Высокоэффективная жидкостная хроматография вэжх принцип метода. Высокоэффективная жидкостная хроматография - High-performance liquid chromatography

«Высокоэффективная жидкостная хроматография загрязнителей природных и сточных вод»

Введение

Глава 1. Основные понятия и классификация методов жидкостной хроматографии

1.1 Аппаратура для жидкостной хроматографии

Глава 2. Сущность ВЭЖХ

2.1 Применение

Глава 3. Примеры использования ВЭЖХ в анализе объектов окружающей среды

Глава 4. Аппаратура для ВЭЖХ

Литература

Приложение

Введение

Хроматографические методы часто оказываются незаменимыми для идентификации и количественного определения органических веществ со сходной структурой. При этом наиболее широко используемыми для рутинных анализов загрязнителей окружающей среды являются газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография. Газохроматографический анализ органических загрязнителей в питьевой и сточных водах сначала основывался на использовании насадочных колонок, позднее распространение получили и кварцевые капиллярные колонки. Внутренний диаметр капиллярных колонок составляет обычно 0,20-0,75 мм, длина - 30-105 м. Оптимальные результаты при анализе загрязнителей в воде достигаются чаще всего при использовании капиллярных колонок с различной толщиной пленки из метилфенилсиликонов с содержанием фенильных групп 5 и 50%. Уязвимым местом хроматографических методик с использованием капиллярных колонок часто становится система ввода пробы. Системы ввода пробы можно подразделить на две группы: универсальные и селективные. К универсальным относятся системы ввода с делением и без деления потока, “холодный” ввод в колонку и испарение при программировании температуры. При селективном вводе используют продувку с промежуточным улавливанием в ловушке, парофазный анализ и т.д. При использовании универсальных систем ввода в колонку поступает вся проба полностью, при селективной инжекции вводится только определенная фракция. Результаты, получаемые при селективном вводе, являются существенно более точными, поскольку попавшая в колонку фракция содержит только летучие вещества, и техника при этом может быть полностью автоматизирована.

Газохроматографические детекторы, используемые в мониторинге загрязнителей, часто подразделяют на универсальные, откликающиеся на каждый компонент в подвижной фазе, и селективные, реагирующие на присутствие в подвижной фазе определенной группы веществ со сходными химическими характеристиками. К универсальным относятся пламенно-ионизационный, атомно-эмиссионный, масс-спектрометрический детекторы и инфракрасная спектрометрия. Селективными детекторами, используемыми в анализе воды, являются электронно-захватный (селективен к веществам, содержащим атомы галогенов), термоионный (селективен к азот- и фосфорсодержащим соединениям), фотоионизационный (селективен к ароматическим углеводородам), детектор по электролитической проводимости (селективен к соединениям, содержащим атомы галогенов, серы и азота). Минимально детектируемые количества веществ - от нанограммов до пикограммов в секунду.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является идеальным методом для определения большого числа термически неустойчивых соединений, которые не могут быть проанализированы с помощью газовой хроматографии. Объектами анализа методом жидкостной хроматографии в настоящее время часто становятся современные агрохимикаты, в число которых входят метилкарбонаты и фосфорорганические инсектициды, другие нелетучие вещества. Высокоэффективная жидкостная хроматография получает все большее распространение среди других методов, применяемых в мониторинге окружающей среды, еще и потому, что имеет блестящие перспективы в плане автоматизации пробоподготовки.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Жидкостную хроматографию подразделяют на несколько классов в зависимости от типа носителя неподвижной фазы. Простое аппаратурное оформление бумажной и тонкослойной хроматографий обусловили широкое использование этих методов в аналитической практике. Однако, большие возможности колоночной жидкостной хроматографии стимулировали совершенствование оборудования для этого классического метода и привели к быстрому внедрению ВЭЖХ. Пропускание элюента через колонку под высоким давлением позволило резко увеличить скорость анализа и существенно повысить эффективность разделения за счет использования мелкодисперсного сорбента. Метод ВЭЖХ в настоящее время позволяет выделять, количественно и качественно анализировать сложные смеси органических соединений.

По механизму взаимодействия разделяемого вещества (элюата) с неподвижной фазой различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, ион-парную, лигандообменную и аффинную хроматографии.

Адсорбционная хроматография . Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия разделяемого вещества с адсорбентом, таким как оксид алюминия или силикагель, имеющими на поверхности активные полярные центры. Растворитель (элюент) - неполярная жидкость. Механизм сорбции состоит в специфическом взаимодействии между полярной поверхностью сорбента и полярными (либо способными поляризоваться) участками молекул анализируемого компонента (рис. 1).

Рис. 1. Адсорбционная жидкостная хроматография.

Распределительная хроматография . При распределительном варианте жидкостной хроматографии разделение смеси веществ осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами - элюентом (подвижной фазой) и фазой, находящейся на сорбенте (неподвижная фаза).

При нормально-фазовом варианте распределительной жидкостной хроматографии используются неполярный элюент и полярные группы, привитые к поверхности сорбента (чаще всего силикагеля). В качестве модификаторов поверхности силикагеля (привитых фаз) используются замещенные алкилхлорсиланы, содержащие полярные группы, такие как нитрильная, аминогруппа и т. д. (рис. 2). Применение привитых фаз позволяет тонко управлять сорбционными свойствами поверхности неподвижной фазы и добиваться высокой эффективности разделения.

Рис. 2. Распределительная хроматография с привитой фазой (нормально-фазный вариант).

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография основана на распределении компонентов смеси между полярным элюентом и неполярными группами (длинными алкильными цепочками), привитыми к поверхности сорбента (рис. 3).

Рис. 3. Распределительная хроматография с привитой фазой (обращенно-фазный вариант).

Менее широко используется вариант жидкостной хроматографии с нанесенными фазами, когда жидкая неподвижная фаза наносится на неподвижный носитель.

Эксклюзивная (гельпроникающая) хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение веществ происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся в порах сорбента и растворителем, протекающим между его частицами.

Аффинная хроматография основана на специфических взаимодействиях разделяемых белков (антител) с привитыми на поверхности сорбента (синтетической смолы) веществами (антигенов), избирательно образующими с белками комплексы (коньюгаты).

Ионообменная, ион-парная, лигандообменная хроматографии применяются в основном в неорганическом анализе.

Основные параметры хроматографического разделения.

Основными параметрами хроматографического разделения являются удерживаемый объем и время удерживания компонента смеси (рис. 4).

Время удерживанияtR - это время, прошедшее от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума соответствующего пика. Умножив время удерживания на объемную скорость элюента F ,получим удерживаемый объем VR:

Исправленое время удерживания - время, прошедшее с момента появления максимума пика несорбируемого компонента до пика соответствующего соединения:

tR" = tR - t0 ;

Приведенный или исправленный объем удерживания - это объем удерживания с поправкой на мертвый объем колонки V0, т. е. на объем удерживания несорбируемого компонента:

VR" = VR - V0;

Характеристикой удерживания является также коэффициент емкости k", определяемый как отношение массы вещества в неподвижной фазе к массе вещества в подвижной фазе: k" = mн / mп;

Величину k" легко определить по хроматограмме:

Важнейшими параметрами хроматографического разделения являются его эффективность и селективность.

Эффективность колонки, измеряемая высотой теоретических тарелок (ВЭТТ) и обратно пропорциональная их числу (N) тем выше, чем уже пик вещества, выходящего при том же времени удерживания. Значение эффективности может быть вычислено по хроматограмме по следующей формуле:

N = 5.54 . (tR / 1/2) 2 ,

где tR - время удерживания,

w 1/2 - ширина пика на половине высоты

Зная число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, длину колонки L и средний диаметр зерна сорбента dc, легко получить значения высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ), и приведенной высоты (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L/N ПВЭТТ = ВЭТТ/d c

Эти характеристики позволяют сравнивать эффективности колонок различных типов, оценивать качество сорбента и качество заполнения колонок.

Селективность разделения двух веществ определяется по уравнению:

При рассмотрении разделения смеси двух компонентов важным параметром служит также степень разделенияRS:

;

Пики считаются разрешенными, если величина RS больше или равна 1.5.

Основные хроматографические параметры связывает следующее уравнение для разрешения:

;

Факторами, определяющими селективность разделения, являются:

1) химическая природа сорбента;

2) состав растворителя и его модификаторов;

3) химическая структура и свойства компонентов разделяемой смеси;

4) температура колонки

1.1 Аппаратура для жидкостной хроматографии

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами.

На рис. 4. представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

Рис. 4. Блок-схема жидкостного хроматографа.

Насос (2) предназначен для создания постоянного потока растворителя. Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы плунжерного (шприцевого), либо пистонного типов. Недостатком первых является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом, а вторых - большая сложность конструкции и, как следствие, высокая цена. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа с успехом применяют недорогие перистальтические насосы, но так как при этом трудно добиться постоянства давления и скорости потока, их использование ограничено препаративными задачами.

Инжектор (3) обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы - "stop-flow" требуют остановки насоса и, поэтому, менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанные фирмой Reodyne.

Колонки (4) для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используют толстостенные стеклянные колонки. Постоянство температуры обеспечивается термостатом (5).

Детекторы (6) для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры, измеряющие показатель преломления, и спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения, которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно.

Колонки для ВЭЖХ, которые чаще всего используют в анализах загрязнителей окружающей среды, имеют длину 25 см и внутренний диаметр 4,6 мм, заполняются они сферическими частицами силикагеля размером 5-10 мкм с привитыми октадецильными группами. В последние годы появились колонки с меньшим внутренним диаметром, заполненными частицами меньшего размера. Использование таких колонок приводит к уменьшению расхода растворителей и продолжительности анализа, увеличению чувствительности и эффективности разделения, а также облегчает проблему подключения колонок к спектральным детекторам. Колонки с внутренним диаметром 3,1 мм снабжают предохранительным картриджем (форколонкой) для увеличения срока службы и улучшения воспроизводимости анализов.

В качестве детекторов в современных приборах для ВЭЖХ используются обычно УФ-детектор на диодной матрице, флуоресцентный и электрохимический.

Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, эксклюзионное разделение бывает осложнено адсорбционными эффектами, адсорбционное - распределительными, и наоборот. При этом чем больше различие веществ в пробе по степени ионизации, основности или кислотности, по молекулярной массе, поляризуемости и другим параметрам, тем больше вероятность проявления другого механизма разделения для таких веществ.

На практике, наибольшее распространение получила «обращённофазовая» (распределительная) хроматография, в которой неподвижная фаза не полярна, а подвижная полярна (т. е. обратна «прямофазной» хроматографии).

В большинстве лабораторий мира группу из 16 приоритетных ПАУ анализируют методами ВЭЖХ или ХМС.

ГЛАВА 2. СУЩНОСТЬ ВЭЖХ

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) характер происходящих процессов в хроматографической колонке, в общем идентичен с процессами в газовой хроматографии. Отличие состоит лишь в применении в качестве неподвижной фазы жидкости. В связи с высокой плотностью жидких подвижных фаз и большим сопротивлением колонок газовая и жидкостная хроматография сильно различаются по аппаратурному оформлению.

В ВЭЖХ в качестве подвижных фаз обычно используют чистые растворители или их смеси.

Для создания потока чистого растворителя (или смесей растворителей), называемого в жидкостной хроматографии элюентом, используются насосы, входящие в гидравлическую систему хроматографа.

Адсорбционная хроматография осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия, как с растворителем, так и с адсорбентом.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом, поверхностью и диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и другие адсорбенты. Основная причина этого:

Недостаточная механическая прочность, не позволяющая упаковывать и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ;

силикагель по сравнению с оксидом алюминия обладает более широким диапазоном пористости, поверхности и диаметра пор; значительно большая каталитическая активность оксида алюминия приводит к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

Детекторы для ВЭЖХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для детектирования полярных нелетучих веществ, которые по каким-либо причинам не могут быть переведены в форму удобную для газовой хроматографии, даже в виде производных. К таким веществам, в частности, относят сульфоновые кислоты, водорастворимые красители и некоторые пестициды, например производные фенил - мочевины.

Детекторы:

УФ - детектор на диодной матрице. «Матрица» фотодиодов (их более двухсот) постоянно регистрирует сигналы в УФ- и видимой области спектра, обеспечивая таким образом запись УФ-В-спектров в режиме сканирования. Это позволяет непрерывно снимать при высокой чувствительности неискаженные спектры быстро проходящих через специальную ячейку компонентов.

По сравнению с детектированием на одной длине волны, которое не дает информации о «чистоте» пика, возможности сравнения полных спектров диодной матрицы обеспечивают получение результата идентификации с гораздо большей степенью достоверности.

Флуоресцентный детектор. Большая популярность флуоресцентных детекторов объясняется очень высокой селективностью и чувствительностью, и тем фактором, что многие загрязнители окружающей среды флуоресцируют (например, полиароматические углеводороды).

Электрохимический детектор используются для детектирования веществ, которые легко окисляются или восстанавливаются: фенолы, меркаптаны, амины, ароматические нитро- и галогенпроизводные, альдегиды кетоны, бензидины.

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медлен-ного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют вы-сокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и совре-менных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и про-ведения качественного и количественного анализа нелетучих термола-бильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОфВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хроматограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца по-следовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из ко-лонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внеш-ней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хроматограмме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

2.1 Применение

Наиболее широкое применение ВЭЖХ находит в следующих областях химического анализа (выделены объекты анализа, где ВЭЖХ практически не имеет конкуренции):

· Контроль качества продуктов питания - тонизирующие и вкусовые добавки, альдегиды, кетоны, витамины, сахара, красители, консерванты, гормональные препараты, антибиотики, триазиновые, карбаматные и др. пестициды, микотоксины, нитрозоамины, полициклические ароматические углеводороды и т.п.

· Охрана окружающей среды - фенолы, органические нитросоединения, моно- и полициклические ароматические углеводороды, ряд пестицидов, главные анионы и катионы.

· Криминалистика - наркотики, органические взрывчатые вещества и красители, сильнодействующие фармацевтические препараты.

· Фармацевтическая промышленность - стероидные гормоны, практически все продукты органического синтеза, антибиотики, полимерные препараты, витамины, белковые препараты.

· Медицина - перечисленные биохимические и лекарственные вещества и их метаболиты в биологических жидкостях (аминокислоты, пурины и пиримидины, стероидные гормоны, липиды) при диагностике заболеваний, определении скорости выведения лекарственных препаратов из организма с целью их индивидуальной дозировки.

· Сельское хозяйство - определение нитрата и фосфата в почвах для определения необходимого количества вносимых удобрений, определение питательной ценности кормов (аминокислоты и витамины), анализ пестицидов в почве, воде и сельхозпродукции.

· Биохимия, биоорганическая химия, генная инженерия, биотехнология - сахара, липиды, стероиды, белки, аминокислоты, нуклеозиды и их производные, витамины, пептиды, олигонуклеотиды, порфирины и др.

· Органическая химия - все устойчивые продукты органического синтеза, красители, термолабильные соединения, нелетучие соединения; неорганическая химия (практически все растворимые соединения в виде ионов и комплексных соединений).

· контроль качества и безопасности продуктов питания, алкогольных и безалкогольных напитков, питьевой воды, средств бытовой химии, парфюмерии на всех стадиях их производства;

· определение характера загрязнений на месте техногенной катастрофы или чрезвычайного происшествия;

· обнаружение и анализ наркотических, сильнодействующих, ядовитых и взрывчатых веществ;

· определение наличия вредных веществ (полициклические и другие ароматические углеводороды, фенолы, пестициды, органические красители, ионы тяжелых, щелочных и щелочно-земельных металлов) в жидких стоках, воздушных выбросах и твердых отходах предприятий и в живых организмах;

· мониторинг процессов органического синтеза, нефте- и углепереработки, биохимических и микробиологических производств;

анализ качества почв для внесения удобрений, наличия пестицидов и гербицидов в почве, воде и в продукции, а также питательной ценности кормов; сложные исследовательские аналитические задачи; получение микроколичества сверхчистого вещества.

ГЛАВА 3. ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЭЖХ В АНАЛИЗЕ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

ВЭЖХ - метод мониторинга ПАУ в объектах окружающей среды

Для полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), экотоксикантов 1-го класса опасности, установлены крайне низкие уровни предельно допустимых концентраций (ПДК) в природных объектах. Определение ПАУ на уровне ПДК и ниже относится к числу очень сложных аналитических задач и для их решения применяются высокотехнологичные методы анализа (ГХ-МС, ГХ, ВЭЖХ). При выборе метода для мониторинга к основным рассматриваемым характеристикам – чувствительность и селективность, добавляются экспрессность и экономичность, т.к. мониторинг предполагает проведение серийного анализа. Вариант ВЭЖХ на коротких колонках малого диаметра в значительной степени отвечает указанным требованиям. С применением данного метода авторами разработаны и аттестованы методики контроля бенз[a]пирена в трех природных средах: аэрозоле, снежном покрове и поверхностных водах. Для методик характерны: простая унифицированная подготовка пробы, включающая экстракцию ПАУ органическими растворителями и концентрирование экстракта, прямое введение сконцентрированного экстракта в хроматографическую колонку, применение многоволнового фотометрического детектирования в УФ области спектра, идентификация пиков ПАУ на хроматограммах с применением двух параметров, время удерживания и спектральное отношение. Суммарная погрешность не превышает 10 % при определении бенз[a]пирена в аэрозоле в диапазоне концентраций от 0.3 до 450 нг/м 3 , в поверхностных водах в диапазоне концентраций от 10 до 1000 нг/л, в снежном покрове в диапазоне поверхностной плотности от 0.5 до 50 мкг/м 2 . Для случая одновременного определения приоритетных ПАУ (до 12 соединений) и регистрации негомогенных пиков аналитов предложено повторное разделение экстракта с изменением селективности подвижной фазы, длины волны детектирования и температуры колонки с учетом индивидуальных свойств определяемого ПАУ.

1 . Качество окружающего воздуха. Массовая концентрация бенз[a]пирена. Методика выполнения измерений методом ВЭЖХ. Свидетельство об аттестации МВИ № 01-2000.

2 . Качество поверхностных и очищенных сточных вод. Массовая концентрация бенз[a]пирена. Методика выполнения измерений методом ВЭЖХ. Свидетельство об аттестации МВИ № 01-2001.

3 . Качество снежного покрова. Массовая концентрация бенз[a]пирена. Методика выполнения измерений методом ВЭЖХ. Свидетельство об аттестации МВИ № 02-2001.

Удаление анилина из водных растворов с использованием отходов алюмотермического восстановления прокатной медной окалины

Проблема удаления углеводородов из сточных вод является актуальной задачей. Во многих химических, нефтехимических и других производствах образуются анилин и его производные, которые являются токсичными веществами. Анилин - сильноядовитое вещество, ПДК - 0,1 мг/м 3 . Анилин и его производные растворимы в воде, поэтому не могут быть удалены гравитационным осаждением.

Одним из лучших методов очистки сточных вод от органических загрязнителей является применение неорганических и органических адсорбентов, способных регенерироваться (алюмосиликаты, модифицированные глины, древесина, волокна и т. д.) и неспособных к регенерации(активированный уголь, макропористые полимерные материалы и т. д.).

Регенерируемые адсорбенты могут удалить из воды органические вещества разной полярности. Поиск эффективных адсорбентов является актуальной задачей.

В настоящем сообщении представлены результаты исследования в области применения прокатной медной окалины Ереванского кабельного завода (ОПМОЕрКЗ) в качестве сорбентов анилина.

Хроматографические исследования проводили на хроматографе ВЭЖХ / высокоэффективная жидкостная хроматография / системы (Waters 486 - detector, Waters 600S - controller, Waters 626 - Pump), на колонке 250 х 4 мм наполненными исследуемыми нами сорбентами, скорость мобильной фазы 1 мл/м / мобильной фазой являются исследуемые нами растворители/, детектор - UV-254. УФ-спектроскопический анализ проведен на спектрофотометре «Specord-50», спектры получены с помощью компьютерной программы ASPECT PLUS.

Точно взвешенные порции сорбентов вносили в определенные объемы анилина в воде, начальные концентрации которых варьировали. Смесь тщательно взбалтывали в течение 6 ч. Далее пробу оставляли для отстоя. Адсорбция завершается практически в течение 48 ч. Количество осажденного анилина определено УФ-спектрофотометрическим, а также рефрактометрическим анализом.

Вначале были исследованы адсорбционные свойства ОПМОЕрКЗ при удалении анилина из раствора в тетрахлорметане. Оказалось, что анилин лучше всего поглощает сорбент 3 (таблица).

Проведены также измерения для водных растворов анилина в концентрациях 0,01- 0,0001 моль/л. В таблице приведены данные по 0,01 М раствору.

Поглощение анилина различными сорбентами из 0,01 М водного раствора анилина при 20°С

Ранее было установлено, что адсорбция в указанных пределах концентраций возрастает и линейно зависит от коэффициента преломления. Количество анилина было определено из графической зависимости «коэффициент преломления - молярная концентрация» и скорректировано данными как жидкостной хроматографии, так и УФ-спектрального анализа.

Наиболее активным для водных растворов является сорбент 3. Количество адсорбированного загрязнителя рассчитывалось как разница между общим количеством загрязнителя, добавленного в начальный раствор, и его остатком в конечном растворе.

Методы определения ПАУ в объектах окружающей среды

Как правило для определения ПАУ используются методы газовой хроматографии (ГХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). разделение основных 16 ПАУ, достаточное для количественного анализа, достигается применением либо капиллярных колонок в газовой хроматографии, либо высокоэффективных колонок применяемых в ВЭЖХ. Необходимо помнить, что колонка, хорошо разделяющая калибровочные смеси шестнадцати ПАУ не гарантирует, что они также хорошо будут разделяться на фоне сопутствующих органических соединений в исследуемых пробах.

В целях упрощения анализа, а также для достижения высокого качества получаемых результатов, большинство аналитических процедур содержит этап предварительного выделения (сепарации) ПАУ среди иных групп сопутствующих соединений в пробах. Чаще всего в этих целях используются методы жидкостной хроматографии низкого давления в системе жидкость-твердое тело или жидкость-жидкость с использованием механизмов адсорбции, например с использованием силикагеля или окиси алюминия, иногда используются смешанные механизмы, например адсорбции и исключения с применением cефадексов.

Использование предварительной очистки проб позволяет при определении ПАУ избежать влияния:

Полностью неполярных соединений, таких, как алифатические углеводороды;

Умеренно и сильно полярных соединений, например, фталанов, фенолов, многоатомных спиртов, кислот;

Высокомолекулярных соединений таких, как, например, смолы.

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используются главным образом два типа детекторов: флуориметрический детектор или спектрофотометрический детектор с фотодиодной линейкой. Предел обнаружения ПАУ при флуориметрическом детектировании очень низкий, что делает этот метод особенно пригодным для определения следовых количеств полиароматических соединений. Однако классические флуориметрические детекторы практически не дают информации о строении исследуемого соединения. Современные конструкции делают возможным регистрацию спектров флуоресценции, которые характеристичны для индивидуальных соединений, но они пока не получили широкого распространения в практике рутинных измерений. Спектрофотометрический детектор с фотодиодной линейкой (ФДЛ) дает возможность регистрации спектров поглощения в УФ- и видимом спектральном диапазоне, эти спектры могут использоваться для идентификации. Аналогичная информация может быть получена с использованием быстросканирующих детекторов.

При выборе аналитической техники, предназначенной для разделения, идентификации и количественного анализа упомянутых ПАУ необходимо учитывать следующие условия:

Уровень определяемых содержаний в исследуемых пробах;

Количество сопутствующих субстанций;

Применяемая аналитическая процедура (методика выполнения измерений);

Возможности серийной аппаратуры.

Разработка методики определения щелочноземельных элементов и магния методом ионной высокоэффективной жидкостной хроматографии

Разработка и совершенствование методов, позволяющих решать задачи анализа вод- важная проблема аналитической химии. Развитие высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления стимулировало развитие нового направления в ионообменной хроматографии- так называемой ионной хроматографии. Синтез сорбентов для ионной хроматографии затруднен, поскольку к ни предъявляется довольно много требований. В связи с отсутствием коммерчески доступных высокоэффективных катионитов, была использована динамически модифицированная обращеная фаза, для чего был синтезирован модификатор: N-гексадецил-N-деканоил-парамино- беноилсульфокислоты этил- диизопропиламмоний (ДГДАСК), где гидрофобный амин, содержащий группу SO 3 - , способный к катионному обмену. После пропускания раствора модификатора поглощение при l = 260 нм достигало 6,4 единиц оптической плотности (° Е) с выходом на плато. Рассчитанная ионообменная емкость составляет 15,65 мкмоль. Так как катионы щелочноземельных элементов и магния не поглощают в УФ- области спектра, использовалась непрямая УФ- детекция с применением синтезированного УФ- поглощающего элюента 1,4- дипиридинийбутана бромида (ДПБ бромид). Так как галоген- ионы разрушают стальные части колонки, то бромид-ион 1,4- дипиридинийбутана заменили на ацетат- ион. При промывании колонки элюентом происходит замена противоиона модификатора- этилдиизопропиламмония на УФ- поглощающий ион 1,4- дипиридинийбутан. Разделение катионов осуществляли при оптимальной длине волны l = 260 нм на шкале 0,4 А в режиме “складывания шкалы”; полярность самописца меняли на обратную. Разделение всех изучаемых катионов достигнуто при ведении комплексообразующей добавки- щавелевой кислоты. Пределы обнаружения Mg 2+ , Ca 2+ , Sr 2+ , Ba 2+ составляют 8 мкг/л; 16 мкг/л; 34 мкг/л; 72 мкг/л соответственно. В выбранных условиях проанализированы водопроводная вода, содержание Ca 2+ в которой составляет 10,6 +1,9 мг-ион/л, Mg 2+ -2,5 + мг-ион/л. Ошибка воспроизводимости не превышает для Ca 2+ -2,2%, для Mg 2+ – 1,4%.

Анализ комплексов кадмия в окружающей среде

Для изучения механизмов миграции тяжелых металлов в биосфере необходимы данные о химических формах существования металлов в природе. Сложности при анализе соединений одного из самых токсичных металлов - кадмия - связаны с тем, что он образует непрочные комплексы, и при попытке их выделить искажаются природные равновесия. В данной работе соединения кадмия в почве и растениях исследованы при помощи методики, основанной на хроматографическом разделении экстрактов с последующей идентификацией компонентов методами химического анализа. Такой подход позволил не только идентифицировать химические формы кадмия, но и прослеживать их трансформации в объектах окружающей среды.

С кадмием в объектах биосферы координируются ОН-группы углеводов и полифенолов (включая флавоноиды), С=О, фосфаты, NH 2 , NO 2 , SH-группы. Для целей настоящего исследования был составлен набор модельных лигандов, представляющих эти классы соединений. Взаимодействие модельных лигандов с водорастворимыми солями кадмия было исследовано методами УФ спектроскопии и ВЭЖХ.

Для выделения соединений кадмия использовали экстракцию специально подобранными (не образующими комплексов с Cd) растворителями. Так удается отделить кадмий от всех тяжелых металлов, кроме его близкого химического аналога – цинка. Кадмий- и цинк,содержащие пики на хроматограммах полученных экстрактов, выявляли при помощи связывания металлов в виде их дитизонатов. Для отделения от цинка использовали различие в устойчивости комплексов Cd и Zn при рН 6-8. Выделенные соединения Cd идентифицировали методом ВЭЖХ с изменением рН в процессе элюирования. Был выполнен анализ соединений кадмия с компонентами почв и тканей растений, а также идентифицированы вещества, вырабатываемые растениями в ответ на увеличение поступления кадмия из почвы. Показано, что у злаков защитными агентами являются флавоноиды, в частности трицин, у бобовых – алкоксипроизводные цистеина, у крестоцветных – как полифенолы, так и тиолы.

ГЛАВА 4. АППАРАТУРА ДЛЯ ВЭЖХ

CЕРИЯ ACCELA

Новый сверхвысокоэффективный жидкостный хроматограф ACCELA cпособен работать в широчайшем диапазоне сокростей потоков и давлений, обеспечивая как типичное для ВЭЖХ разделение на обычных колонках, так и сверхбыстрое и эффективное разделение на колонках с размером частиц сорбента менее 2 мкм при сверхвысоких давлениях (более 1000 атм.).

Система включает квотернарный градиентный инетрный насос, способный создавать давление свыше 1000 атм и с объемом задержки всего 65 мкл, обеспечивающий высокоскоростное хроматографическое разделение. Автосамплер ACCELA способен работать в цикле инжекции образца 30 секунд и обеспечивает высочайшую воспроизводимость ввода. Диодно-матричный детектор Accela PDA с минимизированным объемом проточной ячейки (2 мкл) оптимизирован для работы в режиме высокоскоростной хроматографии, использует патентованную технологию LightPipe и обеспечивает сохранение симметричной формы пиков, которую дает использование безупречных хроматографической системы и колонок.

Система идеально соединяется с масс-спектрометрами для создания самых мощных и лучших из доступных в мире систем ВЭЖХ/МС.

Колонки для рабты в режиме сверхвысокоэффективной хроматографии с размером зерна 1.9 мкм доступны от Thermo Electron для любых применений

CЕРИЯ TSP

Модульный принцип построения приборов ВЭЖХ позволяет заказчику гибко комплектовать оборудование для решения любых аналитических задач, а при их изменении оперативно и экономично его модифицировать. Широкий выбор модулей включает насосы - от изократического до четырехкомпонентного градиентного, от микроколоночного до полупрепаративного, все доступные детекторы, системы ввода образца - от ручных инжекторов до автосамплеров с возможностью любых манипуляций с образцами, мощное программное обеспечение для обработки результатов измерений и управления всеми модулями системы. Все модули сертифицированы по CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, они компактны, обладают современным дизайном, просты в управлении, оснащены встроенным дисплеем и системой самодиагностики, позволяют создавать и сохранять в памяти методы задачи параметров. Они соответствуют критериям "Образцовой Лабораторной Практики" (GLP) и занесены в Реестр Измерительных средств РФ. Протоколы измерений выдаются в соответствии с Фармакопеями Англии, США, Германии и Франции.

Модульные системы TSP отличаются высочайшей надежностью и устойчивостью в эксплуатации.

Сочетание модулей обеспечивает аналитика всеми преимуществами интегральной системы, с одной стороны, и гибкостью модульной системы с другой. В какой бы области применений ВысокоЭффективной Жидкостной Хроматографии (ВЭЖХ) -фармакология, биотехнология, анализ объектов окружающей среды, клинический анализ, анализ пищевых продуктов и напитков, анализ нефтехимической и химической продукции - не использовался этот прибор, он всегда оптимально конфигурируется для того, чтобы соответcтвовать наивысшим требованиям.

Как исследовательская, так и высокопроизводительная рутинная системы обеспечивают:

Высокоэффективную дегазацию растворителя

Возможность работы с малыми и сверхмалыми количествами образца

Высочайшую чувствительность, как с УФ/ВИД детектором, так и с диодной матрицей (со знаменитой LightPipe технологией с длиной оптического пути 1 или 5 см по выбору)

Работу с различными колонкам

Высочайшую точность количественного анализа

Возможность автоматической работы с разными объемами образца

Среднеквадратичную ошибку по временам удерживания менее 0.3 %

Минимальную рабочую площадь, занимаемую системой

Высочайшую надежность и стабильность параметров.

Surveyor LC Pump - ВЭЖХ насос, обладающий лучшими показателями воспроизводимости времен удерживания среди всех доступных в мире четырехкомпонентных градиентных насосов. Интегрированный четырехканальный вакуумный дегазатор и демпфер пульсаций обеспечивают великолепную стабильность базовой линии для достижения максимальной чувствительности и точности количественного анализа.

Автодозатор обеспечивает высочайшую производительность и гибкость анализа. Широкий выбор поддонов для образцов - от стандартных виал до 96 - и 384-луночных микропластин - покрывает потребности практически всех применений. Новая технология обеспечивает ввод пробы практически без потерь, практически 5 мкл образца вводятся автодозатором из полного объема образца в 5 мкл.

SURVEYOR

УФ/Вид детектор и PDA (Детектор с диодной матрицей)

Surveyor UV/Vis - детектор ультрафиолетового и видимого света с переменной длиной волны является комбинацией экономичности и надежности с высочайшей чувствительностью LightPipe технологии. Широкий выбор проточных кювет делает этот детектор универсальным для всех применений от тех, которые используют капиллярную или микроколоночную хроматографию до полупрепаративных и препаративных.

Surveyor PDA детектор является самым чувствительным среди всех ВЭЖХ детекторов, использующих диодную матрицу. Оптика с двухламповым источником безразрывно покрывает весь диапазон длин волн от 190 до 800 нм. Волоконно-оптический формирователь светового пучка обеспечивает великолепное оптическое разрешение без принесения в жертву чувствительности.

Surveyor RI рефрактометрический детектор с термостатированной кюветой минимального объема с полным электронным контролем с компьютера.

Surveyor FL флуориметрический сканирующий детектор с высочайшей чувствительностью и возможностью детекции при флюоресценции, хемилюминесценции и фосфоресценции.

Широкий выбор автосэмплеров позволяет работать как с обычными виалами, так и 96-позиционными планшетами, широко используемыми в биохимии и клинической практике. Работа с ними облегчается благодаря применению аналогичных планшетов для подготовки проб методом твердофазной экстракции.

400 Электрический привод, петля Valco (20 мкл - стандарт) с возможностью частичного заполнения.

Карусель 96 образцов.

Электрический привод, термостат колонки, петля Valco (100 мкл - стандарт) с возможностью частичного заполнения.Режим AutoMix для подготовки проб. Карусель для образцов: 84 х 2 мл (образцы) + Зх 10 мл (реагенты). Встроенный термостат колонки.420

Петлевой автосэмплер для исследовательских работ с возможностью работы в режимах полного, частичного заполнения и ввода микролитровых проб. Широкий выбор каруселей (стандартная - 96 образцов).

Планшетный автосэмплер для работы с 96- и 384-позиционными планшетами. Ввод пробы в петлю под давлением, возможность ввода проб менее 1 мкл. Возможность установки податчика планшетов. ВЭЖХ

Основные производители оборудования для ВЭЖХ

· Waters - сверхпроизводительная хроматография, масс-спектрометрия, колонки, твердофазная экстракция;

· Varian, Inc. - хроматографы и колонки, аксессуары для твердофазной экстракции;

· Agilent Technologies - хроматографы и колонки;

· Hypersil - колонки и сорбенты.

· Merck KGaA - ТСХ пластины и аксессуары для ТСХ, колонки, сорбенты подвижные фазы для ВЭЖХ, аксессуары для твердофазной экстракции

· Dionex - оборудование и колонки для ВЭЖХ, особенно для ионной хроматографии.

Литература

1.Пилипенко А.Т., Пятницкий И.В. Аналитическая химия. В двух книгах: кн..1 – М.: Химия, 1990,-480с.

1. Пилипенко А.Т., Пятницкий И.В. Аналитическая химия. В двух книгах: кн..2 – М.: Химия, 1990,-480с.

2. Васильєв В.П. Аналитическая химия. В 2 ч. Ч. 2. Физико – химические методы анализа: Учеб. для Химко – технол. спец. вузов. – М.: Высш. шк., 1989. – 384с.

3. Гидрохимические материалы. Том 100. Методы и технические средства оперативного мониторинга качества поверхностных вод. Л.: Гидрометео-издат, 1991. – 200с.

4. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия производственных сточных вод / Ю.Ю. Лурье; М.: ХимияЮ, 1984. - 448с.

5. Юинг Г. Инструментальные методы химического анализа / Пер. с англ. М.: Мир, 1989. – 348 с.

6. Горелик Д.О., Конопелько Л.А., Панков Э.Д. Экологический мониторинг. В 2 т. СПб.: Крисмас. 2000. – 260 с.

7. Айвазов Б.В. Введение в хроматографию. М.: Высш. шк., 1983. – 450 с.

8. Гольдберг К.А., Вигдергауз М.С. Введение в газовую хроматографию. М.: Химия, 1990. – 329 с.

9. Столяров Б.В. и др. // Практическая газовая и жидкостная хроматография. СПб.: СПбГУ, 1998. - С. 81.

11. Горшков А.Г., Маринайте И.И. ВЭЖХ - метод мониторинга ПАУ в объектах окружающей среды

12. Торосян Г. О., Мартиросян В. А., Алексанян А. Р., Закарян М. О.. Удаление анилина из водных растворов с использованием отходов алюмотермического восстановления прокатной медной окалины

13. Л.А. Туркина, Г.Н. Королева Разработка методики определения щелочноземельных элементов и магния методом ионной высокоэффективной жидкостной хроматографии

14. Дульцева Г.Г., Дубцова Ю.Ю., Скубневская Г.И. Анализ комплексов кадмия в окружающей среде

Приложение

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛОМАЗОНА В ВОДЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.1415-03

1. Подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф.

Эрисмана; Московской сельскохозяйственной академией им. К.А.

Тимирязева; при участии Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России. Разработчики методики указаны в конце.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом

Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, акад. РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

5. Введены впервые.

1. Вводная часть

Фирма-производитель: ФМС (США).

Торговое название: КОММАНД.

Действующее вещество: кломазон.

2-(2-хлорбензил)-4,4-диметил-3-изоксалидин-3-он(ИЮПАК)

Светло-коричневая вязкая жидкость.

Температура плавления: 25 -С.

Температура кипения: 275 -С.

Давление паров при 25 -С: 19,2 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K logP = 2,5.

Хорошо растворим в ацетоне, гексане, этаноле, метаноле,

хлороформе, дихлорметане и ацетонитриле; растворимость в воде -

1,10 г/куб. дм. Стабилен при комнатной температуре не менее 2 лет, при 50 -С - не менее 3 месяцев.

Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная

токсичность (LD) для крыс - 1369 - 2077 мг/кг; острая дермальная

токсичность (LD) для крыс - более 2000 мг/кг; острая

ингаляционная токсичность (LC) для крыс - 4,8 мг/куб. дм (4 ч).

Гигиенические нормативы. ПДК в воде - 0,02 мг/куб. дм.

Область применения препарата. Кломазон - гербицид избирательного действия, применяемый для борьбы со злаковыми и двудольными сорными растениями в посевах сои и риса при довсходовом или предпосевном внесении.

2. Методика определения кломазона в воде

хроматографическими методами

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип методики

Методика основана на извлечении кломазона из анализируемой пробы гексаном, концентрировании экстракта и последующем количественном определении альтернативными методами:

высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с

ультрафиолетовым детектором, газожидкостной хроматографией (ГЖХ) с детектором постоянной скорости рекомбинации или тонкослойной хроматографией (ТСХ). Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии глобальных загрязнителей окружающей среды: хлорпроизводные циклопарафинов (изомеры ГХЦГ), соединений дифенильного ряда (ДДТ и его производные), их метаболитов - полихлорированных бензолов и фенолов, а также в присутствии трихлорацетата натрия, который может применяться на посевах в качестве гербицида.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода (Р = 0,95)

Реактивы, растворы и материалы

Кломазон с содержанием д. в. 99,8%

(ФМС, США)

Азот, оч ГОСТ 9293-79

Аммиак водный, 25%-ный, ч ГОСТ 1277-81

Ацетон, ч ГОСТ 2603-79

н-Гексан, ч ГОСТ 2603-79

Водорода пероксид, 30%-ный водный раствор ГОСТ 10929-77

Изопропиловый спирт, хч ТУ 6-09-402-75

Кислота серная, хч ГОСТ 4203-77

Кислота хлороводородная (соляная), хч ГОСТ 3118-77

Метиловый спирт, хч ГОСТ

Натрия гидроксид, хч, 25%-ный водный раствор ГОСТ 4323-77

Натрия сульфат безводный, хч ГОСТ 1277-81

Серебра нитрат, хч ГОСТ 1277-81

2-Феноксиметанол, ч ТУ 6-09-3688-76

Хроматон N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм)

с 5% SE-30, Хемапол, Чехия

Хроматон N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм) с 1,5

ОV-17 + 1,95% QF-1, Хемапол, Чехия

Пластинки для ВЭТСХ (СССР)

Пластинки "Кизельгель 60 F-254" (ФРГ)

Пластинки "Силуфол" Чехия

Бумажные фильтры "белая лента", обеззоленные и предварительно промытые гексаном ТУ 6-09-2678-77

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматограф Милихром

с ультрафиолетовым детектором

Хроматографическая колонка стальная,

длиной 64 мм, внутренним диаметром 2 мм,

заполненная Силасорбом 600, зернением 5 мкм

Хроматограф газовый серии "Цвет" или

аналогичный, снабженный детектором постоянной

скорости рекомбинации (ДПР) с пределом

детектирования по линдану 4 x 10 г/куб. см

Хроматографическая колонка стеклянная, длиной

1 или 2 м, внутренним диаметром 2 - 3 мм

Микрошприц типа МШ-10, вместимостью 10 мкл ТУ 5Е2-833-024

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78

Баня водяная ТУ 64-1-2850-76

Весы аналитические типа ВЛА-200 ГОСТ 34104-80Е

Камера хроматографическая ГОСТ 10565-74

Насос водоструйный ГОСТ 10696-75

Облучатель ртутно-кварцевый типа ОКН-11 ТУ 64-1-1618-77

Пульверизаторы стеклянные ГОСТ 10391-74

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М

или аналогичный ТУ 25-11-917-76

Установка компрессорная ТУ 64-1-2985-78

Шкаф сушильный ТУ 64-1-1411-76Е

Воронки делительные ГОСТ 3613-75

Колбы мерные, вместимостью 100 мл ГОСТ 1770-74

Цилиндры мерные, вместимостью 10, 50 мл ГОСТ 1770-74Е

Колбы грушевидные со шлифом,

вместимостью 100 мл ГОСТ 10394-72

Колбы конические, вместимостью 100 мл ГОСТ 22524-77

Пробирки центрифужные, мерные ГОСТ 25336-82Е

Пипетки, вместимостью 0,1, 1, 2, 5 и 10 мл ГОСТ 20292-74

Воронки химические, конусные, диаметром

34 - 40 мм ГОСТ 25336-82Е

2.4. Отбор проб

Отбор, хранение и подготовка проб проводятся в соответствии с

"Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными за N 2051-79 от 21.08.79

Отобранные пробы можно хранить в холодильнике не более 5 дней. Перед анализом воду (при наличии взвеси) фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Метод ВЭЖХ

2.5.1.1. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают с помощью пипетки 5 мл изопопанола и 5 мл метанола, доливают до метки гексаном, перемешивают, фильтруют.

2.5.1.2. Кондиционирование колонки

Промыть колонку для ВЭЖХ смесью гексан-метанол-изопропанол (90:5:5, по объему) в течение 30 мин. при скорости подачи растворителя 100 мкл/мин.

2.5.2. Метод ГЖХ. Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (5% SE-30 на Хроматоне N-AW-DMCS) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 -С в течение 10 -12 ч.

2.5.3. Метод ТСХ

2.5.3.1. Приготовление проявляющих реагентов

2.5.3.1.1. Проявляющий реагент N 1

1 г нитрата серебра растворяют в 1 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 2-феноксиметанола, 190 мл ацетона, 1 - 2 капли пероксида водорода, раствор перемешивают и переносят в склянку из темного стекла.

2.5.3.2.2. Проявляющий реагент N 2

0,5 г нитрата серебра растворяют в 5 мл дистиллированной воды в мерной колбе на 100 мл, добавляют 10 мл 25%-ного водного аммиака, раствор доводят до 100 мл ацетоном, перемешивают и переносят в склянку из темного стекла.

2.5.3.2. Приготовление подвижной фазы для ТСХ

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 20 мл ацетона и добавляют до метки гексан, перемешивают. Смесь наливают в хроматографическую камеру слоем не более 6 - 8 мм за 30 мин. До начала хроматографирования.

2.5.4. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор кломазона с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,8% д. в., в гексане в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрацией 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0; 20 и 40,0 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора кломазона соответствующим последовательным разбавлением гексаном.

Рабочие растворы хранят в холодильнике не более месяца.

2.5.5. Построение градуировочного графика

2.5.5.1. Градуировочный график А (измерение по п. 2.7.1, ВЭЖХ)

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 5 мкл рабочего стандартного раствора кломазона с концентрацией 4,0; 10,0; 20,0 и 40 мкг/мл.

2.5.5.2. Градуировочный график В (измерение по п. 2.7.2, ГЖХ)

Для построения градуировочного графика в испаритель хроматографа вводят по 5 мкл рабочего стандартного раствора кломазона с концентрацией 0,4; 1,0; 2,0; 4,0 и 10,0.

Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят градуировочный график (А или В) зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации кломазона в растворе в мкг/мл.

2.6. Описание определения

100 мл анализируемой пробы воды помещают в делительную воронку вместимостью 250 мл, приливают 10 мл 25%-ного водного раствора гидроксида натрия, перемешивают и добавляют 20 мл н-гексана. Воронку встряхивают в течение 3 мин., после разделения фаз гексановый слой сливают в грушевидную колбу вместимостью 100 мл, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, помещенного в конической воронке на складчатом бумажном фильтре. Извлечение препарата из водной пробы повторяют еще дважды, используя по 20 мл н-гексана. Объединенный гексановый экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 -С почти досуха, остаток отдувают потоком воздуха или азота особой чистоты. Сухой остаток растворяют в 0,1 (ВЭЖХ, ТСХ) или 0,25 мл (ГЖХ) н- гексана и анализируют одним из хроматографических методов.

2.7. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Милихром (Россия).

Колонка стальная длиной 64 мм, внутренним диаметром 2 мм,

заполненная Силасорбом 600, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: гексан-изопропанол-метанол (90:5:5, по объему).

Скорость потока элюента: 100 мкл/мин.

Рабочая длина волны: 240 нм.

Чувствительность: 0,4 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 5 мкл.

Время выхода кломазона: около 6 мин.

Линейный диапазон детектирования: 20 - 200 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 40 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Хроматограф газовый "Цвет-570" с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов.

Колонка стеклянная длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм, заполненная Хроматоном N-AW-DMCS с 5% SE-30 (0,16 - 0,20 мм).

Рабочая шкала электрометра 64 x 10 10Ом.

Скорость движения ленты самописца 200 мм/ч.

Температура термостата колонки - 190 -С

детектора - 300 -С

испарителя - 220 -С

Скорость газа-носителя (азота) - 60 мл/мин.

Объем вводимой пробы - 5 мкл.

Время выхода кломазона - 2,5 мин.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 50 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 10 мкг/мл, разбавляют гексаном.

Для повышения точности идентификации кломазона при совместном присутствии в пробе гамма-ГХЦГ, имеющего близкое время удерживания, кломазон удаляется из пробы обработкой концентрированной серной кислотой. Повторный анализ пробы позволяет установить вклад кломазона в первичный хроматографический сигнал.

Гексановый раствор в колбе, полученный по п. 2.6 количественно

(или его аликвотную часть) наносят на хроматографические пластинки "Силуфол", "Кизельгель 60F-254" или "Пластинки для ВЭТСХ". Рядом наносят стандартные растворы в объеме, соответствующем содержанию кломазона 1, 2, 5 и 10 мкг. Пластинку помещают в камеру для хроматографирования, содержащую смесь н-гексан-ацетон (4:1, по объему). После развития хроматограммы пластинку вынимают из камеры, помещают ее под тягу до испарения растворителей, затем обрабатывают одним из проявляющих реагентов и помещают под ультрафиолетовую лампу на 5 мин. Зона локализации препарата на пластинках "Силуфол", "Пластинках для ВЭТСХ" и "Кизельгель 60F- 254" проявляется в виде серо-бурых пятен с величиной Rf 0,35, 0,85 и 0,43, соответственно. Для определения кломазона методом ТСХ можно использовать пластинки "Алюграм" и "Полиграм" (производства ФРГ). Величина Rf кломазона на этих пластинках составляет 0,37 и 0,38, соответственно.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

5. Разработчики

Юдина Т.В., Федорова Н.Е. (ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана).

Давидюк Е.И. (УкрНИИГИНТОКС, г. Киев); Кисенко М.А., Демченко В.Ф. (Институт медицины труда АН и АМН Украины, г. Киев).

Жидкостная хроматография

Жидкостная хроматография - это вид хроматографии, в котором подвижной фазой , называемой элюентом, является жидкость . Неподвижной фазой может быть твердый сорбент , твердый носитель с нанесенной на его поверхность жидкостью или гель .

Различают колоночную и тонкослойную жидкостную хроматографию. В колоночном варианте через колонку, заполненную неподвижной фазой, пропускают порцию разделяемой смеси веществ в потоке элюента, который движется под давлением или под действием силы тяжести. В тонкослойной хроматографии элюент перемещается под действием капиллярных сил по плоскому слою сорбента, нанесенного на стеклянную пластинку или металлическую фольгу, вдоль пористой полимерной пленки или по полоске специальной хроматографической бумаги. Разработан также метод тонкослойной жидкостной хроматографии под давлением, когда элюент прокачивают через слой сорбента, зажатого между пластинами.

Существуют такие виды жидкостной хроматографии, как аналитическая (для анализа смесей веществ) и препаративная (для выделения чистых компонентов).

Различают жидкостную хроматографию (ЖХ) в ее классическом варианте, проводимую при атмосферном давлении , и высокоскоростную ), осуществляемую при повышенном давлении . В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используют колонки диаметром до 5 мм, плотно упакованные сорбентом с частицами малого размера (3-10 мкм). Для прокачивания элюента через колонку применяют давление до 3.107 Па. Такой вид хроматографии называют хроматографией высокого давления . Пропускание элюента через колонку под высоким давлением позволяет резко увеличить скорость анализа и существенно повысить эффективность разделения за счет использования мелкодисперсного сорбента.

Вариантами ВЭЖХ являются микроколоночная хроматография на наполненных сорбентом колонках малого диаметра и капиллярная хроматография на полых и наполненных сорбентом капиллярных колонках. Метод ВЭЖХ в настоящее время позволяет выделять, количественно и качественно анализировать сложные смеси органических соединений.

Жидкостная хроматография - это важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии , медицине, биотехнологии. Ее используют для:

· изучения процессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратов;

· диагностики в медицине;

· анализа продуктов химического и нефтехимического синтеза, полупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефти, сточных вод;

· изучения изотерм сорбции из раствора, кинетики и селективности химических процессов;

· выделения

· анализа и разделения смесей, их очистки и выделения из них многих биологических веществ, таких как аминокислоты, белки, ферменты, вирусы , нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, гормоны.

В химии высокомолекулярных соединений и в производстве полимеров с помощью жидкостной хроматографии анализируют качество мономеров, изучают молекулярно-массовое распределение и распределение по типам функциональности олигомеров и полимеров, что необходимо для контроля продукции.

Жидкостную хроматографию используют также в парфюмерии, пищевой промышленности , для анализа загрязнений окружающей среды , в криминалистике.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) был разработан и внедрен в середине 70-х годов XX века. Тогда появились первые жидкостные хроматографы.

Жидкостная хроматография является оптимальным методом анализа химически и термически нестойких молекул, высокомолекулярных веществ с пониженной летучестью. Это можно объяснить особой ролью подвижной фазы в ЖХ в отличие от газовой хроматографии: элюент выполняет не только транспортную функцию.

2. Основные понятия и классификация методов жидкостной хроматографии.

По механизму удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой ЖХ различают:

осадочную хроматографию

· адсорбционную хроматографию, в которой разделение осуществляется в результате взаимодействия разделяемого вещества с адсорбентом , таким как, оксид алюминия или силикагель, имеющим на поверхности активные полярные центры . Растворитель (элюент) - неполярная жидкость .

Рис. Схема разделения смеси веществ методом адсорбционной хроматографии

http://www. xumuk. ru/biologhim/bio/img014.jpg

Механизм сорбции состоит в специфическом взаимодействии между полярной поверхностью сорбента и полярными (либо способными поляризоваться) участками молекул анализируемого компонента (рис.). Взаимодействие происходит за счет донорно-акцепторного взаимодействия или образования водородных связей.

Рис. Схема адсорбционной жидкостной хроматографии

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">

Рис. . Распределительная хроматография с привитой фазой (нормально-фазный вариант).

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

При нормально-фазном варианте распределительной жидкостной хроматографии в качестве модификаторов поверхности силикагеля (привитых фаз) используют замещенные алкилхлорсиланы, содержащие полярные группы, такие как нитрильная, аминогруппа и т. д. (рис.). Применение привитых фаз позволяет тонко управлять сорбционными свойствами поверхности неподвижной фазы и добиваться высокой эффективности разделения.

Обращённо-фазовая жидкостная хроматография основана на распределении компонентов смеси между полярным элюентом и неполярными группами (длинными алкильными цепочками), привитыми к поверхности сорбента (рис.). Реже используют вариант жидкостной хроматографии с нанесенными фазами, когда жидкая неподвижная фаза наносится на неподвижный носитель.

Рис. . Распределительная хроматография с привитой фазой (обращенно-фазный вариант). http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

К распределительной жидкостной хроматографии относится и экстракционная жидкостная хроматография , в которой неподвижной фазой служит органический экстрагент, нанесенный на твердый носитель, а подвижной - водный раствор разделяемых соединений. В качестве экстрагентов используют, например, фенолы, триалкилфосфаты, амины, четвертичные аммониевые основания, а также серосодержащие фосфорорганические соединения. Экстракционная жидкостная хроматография применяется для разделения и концентрирования неорганических соединений, например, ионов щелочных металлов, актиноидов и др. близких по свойствам элементов, в процессах переработки отработанного ядерного горючего.

ионообменную хроматографию,

ионитов.

катиониты

аниониты.

амфотерные иониты

амфолиты

Ионит

Катионит

Аниониты

R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (катионный обмен)

R-OH + Na+ + Сl - → R-Сl + Na+ + OH - (анионный обмен)

Иониты должны удовлетворять следующим требованиям: быть химически устойчивыми в различных средах, механически прочными в сухом и особенно в набухшем состоянии, обладать большой поглотительной способностью и способностью хорошо регенерироваться.

В ионообменной (ионной) хроматографии, разделенные анионы (катионы) детектируют в виде кислот (соответствующих оснований) высокочувствительным кондуктометрическим детектором, где высокоэффективные колонки наполнены поверхностно-активным ионитом с небольшой емкостью.

ион-парную хроматографию

лигандообменную хроматографию

различной способности разделяемых соединений образовывать комплексы с катионами переходных металлов

эксклюзионную хроматографию

различиях в размерах молекул

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">

Рис. Схема проведения гель-проникающей хроматографии

аффинную хроматографию

Рис. Схема аффинной хроматографии

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

Затем её удаляют с полимера, пропусканием раствора соединения, обладающего ещё большим сродством к макромолекуле. Особенно эффективна такая хроматография в биотехнологии и биомедицине для выделения ферментов, белков, гормонов.

В зависимости от способа перемещения вещества различают следующие варианты жидкостной хроматографии: проявительный, фронтальный и вытеснительный.
Чаще всего используют проявительный вариант, при котором в колонку в потоке элюента вводят порцию разделяемой смеси. Выход компонентов смеси из колонки регистрируется на хроматограмме в виде пиков. (рис.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">

Рис. Схема проявительного варианта хроматографии

Высота или площадь пиков характеризует концентрацию компонентов , а удерживаемые объемы – качественный состав смеси . Идентификацию компонентов обычно проводят по совпадению времен удерживания со стандартными веществами, также используют химические или физико-химические методы.

При фронтальном варианте (рис.) через колонку непрерывно пропускают смесь разделяемых веществ, которая играет роль подвижной фазы. В итоге можно получить в чистом виде только вещество, которое менее всего сорбируется в колонке.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">

Рис. Схема фронтального варианта хроматографии

Хроматограмма в этом случае представляет собой ступени, высоты которых пропорциональны концентрациям компонентов; удерживаемые объемы определяют по времени удерживания компонентов. При дифференцировании такой хроматограммы получают картину, аналогичную той, которую получают в проявительном варианте.

В вытеснительном варианте компоненты смеси, введенной в колонку, вытесняются элюентом, который адсорбируется сильнее любого компонента. В итоге получают примыкающие друг к другу фракции разделяемых веществ Порядок выхода компонентов определяется силой взаимодействия их с поверхностью сорбента (рис.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">

Рис. Схема вытеснительного варианта хроматографии

3. Основные хроматографические величины и их определение.

При разделении веществ с помощью жидкостной хроматографии могут быть использованы, как указано выше, проявительный, фронтальный и вытеснительный варианты. Чаще всего используют проявительный вариант, при котором в колонку в потоке элюента вводят порцию разделяемой смеси. Выход компонентов смеси из колонки регистрируется на хроматограмме в виде пиков. Из хроматограммы (рис.) определяют:

времена удерживания несорбирующегося (t0), разделенных компонентов (tR1 , tR2, tR3 и т. д.) ; ширину оснований пиков (tw1, tw2 и т. д.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;

b) исправленный удерживаемый объем компонента ,

где t"R - исправленное время удерживания компонента;

c) коэффициент емкости колонки по отношению к данному компоненту ;

d) эффективность колонки характеризуется числом эквивалентных теоретических тарелок

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;

f) разрешение https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">

Коэффициент емкости k" оказывает существенное влияние на величину R S: при изменении k " от 0 до 10 (оптимальные пределы) R S сильно возрастает. Значение k" определяется удвоенной поверхностью сорбента и его количеством в колонке, а также константой адсорбционного равновесия (константой Генри).

Коэффициент селективности α определяется различием констант адсорбционного равновесия двух разделяемых компонентов. При увеличении α (от 1 до ~ 5) R S резко возрастает, при дальнейшем увеличении α - меняется мало. Селективность колонки зависит от таких факторов, как химическая структура поверхности сорбента, состав элюента, температура колонки и строение разделяемых соединений. Так как сорбция хроматографируемых веществ в жидкостной хроматографии определяется попарным взаимодействием трех основных компонентов системы - сорбента, разделяемых веществ и элюента, то изменение состава элюента – это удобный способ оптимизации процесса разделения.

Эффективность колонки зависит от размера частиц и структуры пор адсорбента, от равномерности набивки колонки, вязкости элюента и скорости массообмена. Удлинение колонки не всегда приводит к улучшению разделения, так как возрастает сопротивление колонки, увеличивается давление элюента на входе и время проведения опыта, снижается чувствительность и точность анализа из-за уширения пика анализируемого компонента. Если , то пики двух веществ на хроматограмме разделяются практически полностью. С ростом R S увеличивается время разделения. При R S < 1 - разделение неудовлетворительное. В препаративной хроматографии в связи с введением сравнительно больших количеств разделяемых веществ колонка работает с перегрузкой. При этом снижается коэффициент емкости, возрастает высота, эквивалентная теоретической тарелке, что приводит к уменьшению разрешения.

4. Адсорбенты

Хроматографическое разделение смеси будет эффективным, если правильно подобраны адсорбент и растворитель (элюент).

Адсорбент не должен химически взаимодействовать с разделяемыми компонентами, проявлять каталитическое воздействие на растворитель. Также необходимо, чтобы адсорбент обладал избирательностью по отношению к компонентам смеси. Правильно подобранный адсорбент должен иметь максимальную поглотительную способность.

Различают полярные (гидрофильные) и неполярные (гидрофобные) адсорбенты . Следует помнить о том, что адсорбционное сродство полярных веществ к полярным сорбентам значительно выше, чем неполярных.

В качестве адсорбентов применяют оксид алюминия, активированные угли, силикагель, цеолиты, целлюлозу и некоторые минералы.

Оксид алюминия Al2 O3 – амфотерный адсорбент .(рис.) На нем можно разделять смеси веществ в полярных , так и в неполярных растворителях . Нейтральный оксид алюминия используют обычно для хроматографирования из неводных растворов предельных углеводородов, альдегидов, спиртов, фенолов, кетонов и эфиров.

Рис. Оксид алюминия для хроматографии

http://images. /542857_w200_h200_product5.jpg

Активность Al2O3 зависит от содержания в нем влаги. Самую высокую активность имеет безводный оксид алюминия. Её условно принимают за единицу. При необходимости можно приготовить оксид алюминия с различным содержанием влаги путем смешения свежеприготовленного оксида алюминия с водой (шкала Брокмана).

Зависимость активности оксида алюминия от содержания влаги

Например, для разделения углеводородов применяют Al2O3 с активностью 1,5-2; для разделения спиртов и кетонов – 2-3,5.

Удельная поверхность оксида алюминия 230-380 м2/г.

Силикагель (гидроксилированный или химически модифицированный) – это высушенный желатинообразный диоксид кремния, который получают из пересыщенных растворов кремниевых кислот (n SiO2·m H2O) при pH > 5-6. (рис.) Твёрдый гидрофильный сорбент.

Рис. Силикагель

http://www. silicagel. /

http://silikagel. ru/images/askg. gif

Размер частиц силикагеля в аналитических колонках 3-10 мкм, в препаративных - 20-70 мкм. Малый размер частиц увеличивает скорость массообмена и повышает эффективность колонки. Современные аналитические колонки имеют длину 10-25см. Они заполнены силикагелем с размером частиц 5 мкм и позволяют разделить сложные смеси из 20-30 компонентов. При уменьшении размера частиц до 3-5 мкм возрастает эффективность колонки, но и растет ее сопротивление. Так для достижения скорости потока элюента 0,5-2,0 мл/мин требуется давление (1-3)·107Па. Силикагель выдерживает такой перепад давления, гранулы же полимерных сорбентов более эластичны и деформируются. В последнее время разработаны механически прочные полимерные сорбенты макропористой структуры с густой сеткой, которые по своей эффективности приближаются к силикагелям. Форма частиц сорбента размером 10 мкм и выше не оказывает большого влияния на эффективность колонки, однако предпочитают сорбенты сферической формы, которые дают более проницаемую упаковку.(рис.)

Рис. Силикагель сферической формы

http://images. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Внутренняя структура частицы силикагеля представляет собой систему сообщающихся каналов. Для жидкостной хроматографии используют сорбенты с диаметром пор 6-25 нм. Разделение жидкостной хроматографии в проводят, в основном, на силикагелях, модифицированных реакцией алкил - и арилхлорсиланов или алкилэтоксисиланов с силанольными группами поверхности. С помощью таких реакций прививают группы С8Н17-, С18Н37- или С6Н5- (для получения сорбентов с гидрофобизированной поверхностью), нитрильные, гидроксильные группы и др. (рис.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">

Рис. Структура модифицированного силикагеля

Силикагели используют в хроматографии для разделения смесей нефтепродуктов, высших жирных кислот, их сложных эфиров, ароматических аминов, нитропроизводных органических соединений . Силикагель – гидрофильный сорбент , легко смачивается водой. Поэтому его нельзя использовать для сорбции из водных растворов. Активность силикагеля зависит от содержания в нем воды: чем меньше в нем воды, тем больше активность (шкала Брокмана).

Зависимость активности силикагеля от содержания влаги

Удельная поверхность силикагелей равна 500-600 м2/г.

Активированные угли являются формой углерода, который в процессе обработки становится чрезвычайно пористым и приобретает очень большую площадь поверхности, предназначенную для адсорбции или химических реакций.(рис.) Они имеют удельную поверхность 1300-1700 м2/г.

Рис. Активированный уголь

http://e-catalog. rusbiz. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg

Основное влияние на структуру пор активированных углей оказывают исходные материалы для их получения. Активированные угли на основе скорлупы кокосов характеризуются большей долей микропор (до 2 нм), на основе каменного угля - большей долей мезопор (2-50 нм). Большая доля макропор характерна для активированных углей на основе древесины (более 50 нм). Микропоры особенно хорошо подходят для адсорбции молекул небольшого размера, а мезопоры - для адсорбции более крупных органических молекул.

Цеолиты (молекулярные сита) – пористые кристаллические алюмосиликаты щелочных и щелочноземельных металлов природного и синтетического происхождения. (рис.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">

Рис. Цеолиты

http://www. zeolite. spb. ru/_img/_36mm. jpg

http://kntgroup. ru/thumb. php? file=/uploads/produkts/6.jpg&x_width=250

Известны четыре типа цеолитов (A, X, Y, M), имеющие различную кристаллическую структуру. В зависимости от катиона цеолиты обозначают следующим образом: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Особенностью цеолитов является то, что поры кристаллов имеют размеры порядка 0,4-1 нм, соизмеримые с размерами молекул многих жидких или газообразных веществ. Если молекулы вещества способны проникать в эти поры, то происходит адсорбция в порах кристаллов цеолитов. Более крупные молекулы вещества не адсорбируются. Подбирая цеолиты с разными размерами пор, можно четко разделить смеси различных веществ.

Удельная поверхность цеолитов 750-800 м2/г.

При выборе адсорбента необходимо учитывать строение веществ и их растворимость. Например, предельные углеводороды адсорбируются плохо, а непредельные (имеют двойные связи) – лучше. Функциональные группы усиливают способность вещества к адсорбции.

5. Элюенты

При выборе растворителя (элюента) нужно учитывать природу адсорбента и свойства веществ в разделяемой смеси. Элюенты должны хорошо растворять все компоненты хроматографируемой смеси, обладать низкой вязкостью, обеспечивать необходимый уровень селективности, быть дешевыми, нетоксичными, инертными, совместимыми с методами детектирования (например, с УФ детектором нельзя использовать в качестве элюента бензол).

В нормально-фазной хроматографии обычно используют углеводороды (гексан, гептан, изооктан, циклогексан) с добавлением небольших количеств хлороформа СНСl3, изо-пропанола изо-С3Н7ОН, диизопропилового эфира; в обращенно-фазной хроматографии - смесь воды с ацетонитрилом CH3CN, метанолом СН3ОН, этанолом С2Н5ОН, диоксаном, тетрагидрофуран, диметилформамид. Для выделения отдельных компонентов смеси, разделившихся при хроматографировании, часто проводят их последовательное вымывание (элюирование). С этой целью применяют растворители с различной десорбционной способностью. Растворители располагают в порядке убывания десорбирующей способности в полярных адсорбентах – элюотропный ряд Траппе . Если компоненты разделяемой смеси имеют близкие значения k" (коэффициент емкости колонки по отношению к данному компоненту), то хроматографируют одним элюентом. Если отдельные компоненты смеси сильно удерживаются сорбентом, используют серию элюентов возрастающей силы.

Элюотропный ряд растворителей

6. Аппаратура для жидкостной хроматографии

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем до хроматографов высокого класса.
Современный жидкостной хроматограф включает: емкости для элюентов, насосы высокого давления, дозатор, хроматографическую колонку, детектор, регистрирующий прибор, систему управления и математические обработки результатов.

На рис. представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">

Рис. Схема жидкостного хроматографа: 1- резервуар для подвижной фазы, 2- насос, 3- инжектор, 4- колонка, 5- термостат, 6- детекторы, 7- регистрирующая система,8- компьютер.

Резервуар для подвижной фазы, должен иметь достаточную для проведения анализа вместимость и устройство для дегазации растворителя , чтобы исключить образование в колонке и детекторе пузырьков растворенных в элюенте газов.

Насос предназначен для создания постоянного потока растворителя . Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используют насосы плунжерного (шприцевого) типа. Недостатком их является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа применяют недорогие перистальтические насосы. Элюенты поступают в насос через фильтр, задерживающий пылевые частицы (больше 0,2 мкм). Иногда через элюенты пропускают небольшой ток гелия для удаления растворенного воздуха и предотвращения образования пузырьков в детекторе (особенно в случае водных и полярных элюентов). В аналитических хроматографах для подачи элюента в колонку используют поршневые насосы с системой обратной связи, позволяющие сглаживать пульсацию потока в пределах 1-2% и обеспечивать объемные скорости от 0,1 до 25 мл/мин при давлении до ~ 3.107 Па. В микроколоночной хроматографии объемные скорости потока элюента значительно ниже - 10-1000 мкл/мин. В случае градиентного элюирования используют несколько насосов, которые управляются программатором и подают в камеру смешения 2-3 компонента элюента, оставляя постоянной общую скорость потока. Для введения пробы в колонку, находящуюся под большим давлением, без остановки потока используют специальные микродозирующие краны, связанные с петлей известного объема для исследуемой пробы раствора. Разработаны дозировочные системы с автоматическим отбором и вводом пробы с помощью микродозирующих кранов или шприцов.

Инжектор обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы - "stop-flow" требуют остановки насоса и, поэтому, менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанные фирмой Reodyne.

Колонки для ВЭЖХ изготовляют чаще всего из нержавеющей стальной полированной трубки длиной 10-25см и внутренним диаметром 3-5мм.

Рис. Хроматографические колонки для жидкостной хроматографии

Используют также стеклянные колонки , помещенные в металлический кожух; в микроколоночной хроматографии - набивные металлические колонки с внутренним диаметром 1,0-1,5мм, набивные стеклянные микроколонки диаметром 70-150 мкм и полые капиллярные колонки диаметром 10-100 мкм; в препаративной хроматографии - колонки диаметром от 2 до 10см и более. Для равномерного и плотного заполнения колонок сорбентом используют суспензионный метод набивки. Суспензию готовят из сорбента и подходящей органической жидкости, которая подается под давлением до 5·107 Па в колонку. Для определения выходящих из колонки разделенных компонентов используют детекторы . Постоянство температуры обеспечивается термостатом .

Детекторы для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Они должны быть очень чувствительными. Для увеличения чувствительности детектора иногда применяют дериватизацию компонентов смеси после колонки. Для этого с потоком элюента вводят такие реагенты, которые, взаимодействуя с разделенными веществами, образуют производные с более выраженными свойствами, например, сильнее поглощают в УФ или видимой области спектра или обладают большей флуоресцирующей способностью. Иногда дериватизацию проводят до хроматографического анализа и разделяют производные, а не исходные вещества. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры , измеряющие показатель преломления , и спектрофотометрические детекторы , определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров ) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения , которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно.

Дифференциал" href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">дифференциального усилителя и самописца. Желательно также наличие интегратора , позволяющего рассчитывать относительные площади получаемых пиков. В сложных хроматографических системах используется блок интерфейса , соединяющий хроматограф с персональным компьютером , который осуществляет не только сбор и обработку информации , но и управляет прибором, рассчитывает количественные характеристики и, в некоторых случаях, качественный состав смесей. Микропроцессор обеспечивает автоматический ввод пробы , изменение по заданной программе состава элюента при градиентном элюировании, поддержание температуры колонки .

Bruker". Рис. Жидкостный хроматограф Jasco

Вопросы для самопроверки

Что такое жидкостная хроматография? Назовите её виды, области применения. Перечислите о сновные хроматографические величины и их определение Какие виды жидкостной хроматографии существуют в зависимости от механизма удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой ЖХ? Какие виды хроматографии существуют в зависимости от способа перемещения вещества? Какие вещества используют в качестве адсорбентов? Чем они отличаются? Что служит жидкой подвижной фазой - элюентом? Требования к растворителям. В чем отличие распределительной хроматографии от адсорбционной хроматографии? Перечислите основные части схемы жидкостного хроматографа, их назначение.

Список использованной литературы

1 « Жидкостная хроматография в медицине »

Http://journal. issep. rssi. ru/articles/pdf/0011_035.pdf

2 « Ознакомление с методами высокоэффективной жидкостной хроматографии »

Http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

3 « Жидкостная хроматография »

Http://e-science. ru/index/?id=1540

4 « Хроматография »

Http://belchem. narod. ru/chromatography1.html

Введение

Глава 1. Основные понятия и классификация методов жидкостной хроматографии

1.1 Аппаратура для жидкостной хроматографии

Глава 2. Сущность ВЭЖХ

2.1 Применение

Глава 3. Примеры использования ВЭЖХ в анализе объектов окружающей среды

Глава 4. Аппаратура для ВЭЖХ

Литература

Приложение

Введение

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Рис. 1. Адсорбционная жидкостная хроматография.

Рис. 2. Распределительная хроматография с привитой фазой (нормально-фазный вариант).

Рис. 3. Распределительная хроматография с привитой фазой (обращенно-фазный вариант).

Ионообменная, ион-парная, лигандообменная хроматографии применяются в основном в неорганическом анализе.

Основные параметры хроматографического разделения.

Время удерживания tR - это время, прошедшее от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума соответствующего пика. Умножив время удерживания на объемную скорость элюента F , получим удерживаемый объем VR:

tR" = tR - t0;

VR" = VR - V0;

Величину k" легко определить по хроматограмме:

Важнейшими параметрами хроматографического разделения являются его эффективность и селективность.

N = 5.54 . (tR / 1/2) 2 ,

где tR - время удерживания,

w 1/2 - ширина пика на половине высоты

ВЭТТ = L/N ПВЭТТ = ВЭТТ/d c

Селективность разделения двух веществ определяется по уравнению:

При рассмотрении разделения смеси двух компонентов важным параметром служит также степень разделения RS:

;

Пики считаются разрешенными, если величина RS больше или равна 1.5.

Основные хроматографические параметры связывает следующее уравнение для разрешения:

;

Факторами, определяющими селективность разделения, являются:

1) химическая природа сорбента;

2) состав растворителя и его модификаторов;

3) химическая структура и свойства компонентов разделяемой смеси;

4) температура колонки

1.1 Аппаратура для жидкостной хроматографии

Рис. 4. Блок-схема жидкостного хроматографа.

В большинстве лабораторий мира группу из 16 приоритетных ПАУ анализируют методами ВЭЖХ или ХМС.

ГЛАВА 2. СУЩНОСТЬ ВЭЖХ

В ВЭЖХ в качестве подвижных фаз обычно используют чистые растворители или их смеси.

недостаточная механическая прочность, не позволяющая упаковывать и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ;

Детекторы для ВЭЖХ

Детекторы:

2.1 Применение

Контроль качества продуктов питания - тонизирующие и вкусовые добавки, альдегиды, кетоны, витамины, сахара, красители, консерванты, гормональные препараты, антибиотики, триазиновые, карбаматные и др. пестициды, микотоксины, нитрозоамины, полициклические ароматические углеводороды и т.п.

Охрана окружающей среды - фенолы, органические нитросоединения, моно- и полициклические ароматические углеводороды, ряд пестицидов, главные анионы и катионы.

Криминалистика - наркотики, органические взрывчатые вещества и красители, сильнодействующие фармацевтические препараты.

Фармацевтическая промышленность - стероидные гормоны, практически все продукты органического синтеза, антибиотики, полимерные препараты, витамины, белковые препараты.

Медицина - перечисленные биохимические и лекарственные вещества и их метаболиты в биологических жидкостях (аминокислоты, пурины и пиримидины, стероидные гормоны, липиды) при диагностике заболеваний, определении скорости выведения лекарственных препаратов из организма с целью их индивидуальной дозировки.

Сельское хозяйство - определение нитрата и фосфата в почвах для определения необходимого количества вносимых удобрений, определение питательной ценности кормов (аминокислоты и витамины), анализ пестицидов в почве, воде и сельхозпродукции.

Биохимия, биоорганическая химия, генная инженерия, биотехнология - сахара, липиды, стероиды, белки, аминокислоты, нуклеозиды и их производные, витамины, пептиды, олигонуклеотиды, порфирины и др.

Органическая химия - все устойчивые продукты органического синтеза, красители, термолабильные соединения, нелетучие соединения; неорганическая химия (практически все растворимые соединения в виде ионов и комплексных соединений).

контроль качества и безопасности продуктов питания, алкогольных и безалкогольных напитков, питьевой воды, средств бытовой химии, парфюмерии на всех стадиях их производства;

определение характера загрязнений на месте техногенной катастрофы или чрезвычайного происшествия;

обнаружение и анализ наркотических, сильнодействующих, ядовитых и взрывчатых веществ;

определение наличия вредных веществ (полициклические и другие ароматические углеводороды, фенолы, пестициды, органические красители, ионы тяжелых, щелочных и щелочно-земельных металлов) в жидких стоках, воздушных выбросах и твердых отходах предприятий и в живых организмах;

мониторинг процессов органического синтеза, нефте- и углепереработки, биохимических и микробиологических производств;

ГЛАВА 3. ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЭЖХ В АНАЛИЗЕ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

ВЭЖХ - метод мониторинга ПАУ в объектах окружающей среды

Поглощение анилина различными сорбентами из 0,01 М водного раствора анилина при 20°С

Методы определения ПАУ в объектах окружающей среды

Использование предварительной очистки проб позволяет при определении ПАУ избежать влияния:

Полностью неполярных соединений, таких, как алифатические углеводороды;

Умеренно и сильно полярных соединений, например, фталанов, фенолов, многоатомных спиртов, кислот;

Высокомолекулярных соединений таких, как, например, смолы.

Уровень определяемых содержаний в исследуемых пробах;

Количество сопутствующих субстанций;

Применяемая аналитическая процедура (методика выполнения измерений);

Возможности серийной аппаратуры.

Анализ комплексов кадмия в окружающей среде

ГЛАВА 4. АППАРАТУРА ДЛЯ ВЭЖХ

CЕРИЯ ACCELA

CЕРИЯ TSP

Модульные системы TSP отличаются высочайшей надежностью и устойчивостью в эксплуатации.

Воздух внутри помещений: методы контроля и очистки. Контроль источника вредных веществ и окружающей среды. Газоанализаторы: применение и их современные виды для контроля состава газовой смеси - универсальные фотометрические жидкостные и ленточные.

Мониторинг как система наблюдения и контроля оружающей среды. Методы контроля загрязняющих веществ в объектах окружающей среды.

Разделение анионов методом одноколоночной ионной хроматографии. Изображение структуры частицы ионообменной смолы. Примеры использования ионообменной хроматографии в анализе объектов окружающей среды. Особенности анализа пива методом ионной хроматографии.

Общая характеристика хлорорганических соединений, их основные физико-химические свойства и сферы применения, негативное влияние на окружающую среду, организм животных, рыб и человека. Хлорорганические пестициды в продуктах питания и методы их определения.

Основы планарной (тонкослойной) хроматографии: состояние и перспективы использования современных инструментальных методов анализа пестицидов, хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах и табачных изделиях хроматографией в тонком слое.

Методы, доступные для отбора проб воздуха в помещении для анализа. Принцип действия колориметрических трубок. Изменение цвета определенного реагента при вступлении в контакт с тем или иным загрязнителем. Обнаружение летучих органических соединений.

Теоретические основы флуометрии (люминисценции), области её применения в анализе объектов окруающей среды и современное оборудование для исследований. Необычайная чувствительность и скорость люминисцентного анализа. Проблемы подвода энергии возбуждения.

Развитие химико-аналитической аппаратуры не только не снимает проблему качества выполняемых измерений, но, напротив, предъявляет все более высокие требования во всех аспектах проведения измерений.

Общие сведения о промышленном объекте. Климатические условия района. Технологическая цепочка. Источники загрязнения и нарушения природной среды. Загрязнение природных вод. Пункты наблюдения качества поверхностных вод. Отбор проб воды и методы анализа.

Широкий спектр органических соединений, вводимых в окружающую среду в процессе хозяйственной деятельности человека, приводит к тому, что данные вещества стали являться основными поллютантами, определяющими характер техногенного загрязнения гидросферы.

Характеристика спектроскопических методов анализа. Сущность экстракционно-фотометрических методов. Примеры использования метода для определения тяжелых металлов в природных водах. Методика выявления бромид-ионов, нитрат–ионов. Современное оборудование.

Понятие и назначение газовой хроматографии, параметры ее удерживания. Время удерживания и удерживаемый объем. Уравнения в газовой хроматографии. Дополнительные устройства для газовой хроматографии. Контроль загрязненности воздуха в чрезвычайных ситуациях.

Понятие и характеристика метода масс-спектрометрии. Масс-спектрометры с двойной фокусировкой в масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой. Использование хромато–масс–спектрометрии в идентификации загрязнителей природных сред, оборудование.

Методы оценки загрязнения газовых потоков. Основные требования к отбору проб газа и его анализу и методы измерений. Методы оценки параметрических загрязнений. Методы оценки загрязнения водной среды, почв, грунтов и растительности. Идентификации изменений.

Определение тысячных долей процента содержания вещества в чистых металлах оптическими методами анализа с помощью адсорбционных методов спектрофотомерией, фотоколориметрией и колориметрией. Продажа химико-аналитического оборудования через web-сайты.

Назначение и основные принципы реализации кондуктометрических методов анализа. Разновидности используемых методов и особенности их применения. Примеры использования кондуктометрии в анализе объектов окружающей среды и необходимое для этого оборудование.

Применительно к природным водам рассмотрены проблемы количественного определения и разделения на антропогенную и естественную составляющие углеводородов (СН).

Сорбционные методы очистки воды в настоящее время находят все более широкое применение, и одним из наиболее часто применяемім сорбентом является активный уголь.

Основные виды хроматографии. Применение хроматографических методов в экологическом мониторинге. Применение хроматографии в анализе объектов окружающей среды. Современное аппаратурное оформление. Методы проявления хроматограмм и работа хроматографа.

Мониторинг природных вод физико-химическими методами: планарная (тонкослойная хроматография) и её применение для нализа вод. Разделение смеси веществ в плоском слое сорбента и растворителе. Интенсивность люминесценции нефтепродуктов на флюориметре.

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Взамен ст. ГФ XI

Высокоэффективная жидкостная хроматография (жидкостная хроматография высокого давления) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии характеризуются высоким гидравлическим сопротивлением на входе.

В зависимости от механизма разделения веществ различают следующие варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, хиральную и др. в соответствии с характером основных проявляющихся межмолекулярных взаимодействий. В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности сорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля. В распределительной высокоэффективной жидкостной хроматографии разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной (как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и подвижной фазами.

В зависимости от типа подвижной и неподвижной фазы различают нормально-фазовую и обращенно-фазовую хроматографию. В нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии неподвижная фаза – полярная (чаще всего силикагель или силикагель с привитыми NH 2 — или CN-группами и др.), а подвижная фаза – неполярная (гексан, либо смеси гексана с более полярными органическими растворителями – хлороформом, спиртами и т.д.). Удерживание веществ растет с увеличением их полярности. В нормально-фазовой хроматографии элюирующая способность подвижной фазы увеличивается с ростом ее полярности.

В обращенно-фазовой хроматографии неподвижная фаза – неполярная (гидрофобные силикагели с привитыми группами С4, С8, С18 и др.); подвижная фаза – полярная (смеси воды и полярных растворителей: ацетонитрила, метанола, тетрагидрофурана и др.). Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Чем больше содержание органического растворителя, тем выше элюирующая способность подвижной фазы.

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоциированные в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через сорбент (катионит или анионит) за счет различной силы взаимодействия определяемых ионов с ионными группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из колонки выходят наиболее крупные молекулы, способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы, а последними выходят вещества с малыми размерами молекул.

В хиральной хроматографии происходит разделение оптически активных соединений на отдельные энантиомеры. Разделение может осуществляется на хиральных неподвижных фазах или на ахиральных неподвижных фазах с использованием хиральных подвижных фаз.

Существуют и другие варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии.

часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно, в зависимости от типа подвижной и неподвижной фаз, а также природы определяемого соединения.

Область применения

Высокоэффективная жидкостная хроматография успешно применяется как для качественного, так и для количественного анализа лекарственных средств в испытаниях «Подлинность», «Посторонние примеси», «Растворение», «Однородность дозирования», «Количественное определение». Следует отметить, что хроматография позволяет совмещать в одной пробе несколько испытаний, в том числе «Подлинность» и «Количественное определение».

Оборудование

Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

В состав жидкостного хроматографа обычно входят следующие основные узлы:

— узел подготовки подвижной фазы, включая емкость с подвижной фазой (или емкости с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фазы) и систему дегазации подвижной фазы;

— насосная система;

— смеситель подвижной фазы (при необходимости);

— система ввода пробы (инжектор), может быть ручным или автоматическим (автосамплер);

— хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате);

— детектор (один или несколько с разными способами детектирования);

— система управления хроматографом, сбора и обработки данных.

Помимо этого в состав хроматографа могут входить: система пробоподготовки и предколоночный реактор, система переключения колонок, постколоночный реактор и другое оборудование.

Насосная система

Насосы обеспечивают подачу подвижной фазы в колонку с заданной скоростью. Состав подвижной фазы и скорость потока могут быть постоянными или меняющимся во время анализа. В случае постоянного состава подвижной фазы процесс называют изократическим, а во втором – градиентным. Современная насосная система жидкостного хроматографа состоит из одного или нескольких насосов, управляемых компьютером. Это позволяет менять состав подвижной фазы по определенной программе при градиентном элюировании. Насосы для аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяют поддерживать скорость подачи подвижной фазы в колонку в интервале от 0,1 до 10 мл/мин при давлении на входе в колонку до 40 МПа. Пульсации давления минимизируются специальными демпферными системами, входящими в конструкцию насосов. Рабочие детали насосов изготавливаются из коррозионностойких материалов, что позволяет использовать в составе подвижной фазы агрессивные компоненты.

Смесители

В смесителе происходит образование единой подвижной фазы из отдельных растворителей, подаваемых насосами, если необходимая смесь не была приготовлена заранее. Смешение компонентов подвижной фазы в смесителе может происходить как при низком давлении (до насосов), так и при высоком давлении (после насосов). Смеситель можно использовать для подготовки подвижной фазы и при изократическом элюировании.

Объем смесителя может влиять на время удерживания компонентов при градиентном элюировании.

Инжекторы

Инжекторы могут быть универсальными, с возможностью изменения объема вводимой пробы, или дискретными для ввода пробы только определенного объема. Оба типа инжекторов могут быть автоматическими («автоинжекторы» или «автосэмплеры»). Инжектор для ввода пробы (раствора) расположен непосредственно перед хроматографической колонкой. Конструкция инжектора позволяет изменять направление потока подвижной фазы и осуществлять предварительное введение пробы в петлю-дозатор определенного объема (обычно от 10 до 100 мкл) или в специальное дозирующее устройство переменного объема. Объем петли указан на ее маркировке. Конструкция дискретного инжектора, как правило, позволяет осуществлять замену петли. Современные автоматические инжекторы могут обладать рядом дополнительных функций, например, выполнять функцию станции пробоподготовки: осуществлять смешение и разбавление образцов, проводить реакцию предколоночной дериватизации.

Хроматографическая колонка

Хроматографические колонки обычно представляют собой трубки из нержавеющей стали, стекла или пластика, заполненные сорбентом и закрытые с обеих сторон фильтрами с диаметром пор 2–5 мкм. Длина аналитической колонки может находиться в диапазоне от 5 до 60 см и более, внутренний диаметр – от 2 до 10 мм. Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм используются в микроколоночной хроматографии. Существуют также капиллярные колонки с внутренним диаметром около 0,3–0,7 мм. Колонки для препаративной хроматографии могут иметь внутренний диаметр 50 мм и более.

Перед аналитической колонкой могут устанавливаться короткие колонки (предколонки), выполняющие различные вспомогательные функции, основная из которых — защита аналитической колонки. Обычно анализ проводят при комнатной температуре, однако для увеличения эффективности разделения и сокращения продолжительности анализа может быть использовано термостатирование колонок при температурах до 80 — 100 °С. Возможность использования повышенной температуры при разделении ограничивается стабильностью неподвижной фазы, поскольку при повышенных температурах возможна ее деструкция.

Неподвижная фаза (сорбент)

В качестве сорбентов обычно применяются:

силикагель, оксид алюминия, используются в нормально-фазовой хроматографии. Механизм удерживания в данном случае – обычно адсорбция;
силикагель, смолы или полимеры с привитыми кислотными или основными группами. Область применения – ионообменная и ионная хроматография;
силикагель или полимеры с заданным распределением размеров пор (эксклюзионная хроматография);
химически модифицированные сорбенты (сорбенты с привитыми фазами), приготовленные чаще всего на основе силикагеля. Механизм удерживания ‑ адсорбция или распределение между подвижной и неподвижной фазами. Область применения зависит от типа привитых функциональных групп. Некоторые типы сорбентов могут использоваться как в обращенной, так и в нормально фазовой хроматографии;
химически модифицированные хиральные сорбенты, например, производные целлюлозы и амилозы, протеины и пептиды, циклодекстрины, хитозаны, используемые для разделения энантиомеров (хиральная хроматография).

Сорбенты с привитыми фазами могут иметь различную степень химической модификации. В качестве привитых фаз наиболее часто применяются:

– октадецильные группы (сорбент октадецилсилан (ODS) или С 18);

– октильные группы (сорбент октилсилан или С 8);

– фенильные группы (сорбент фенилсилан);

– цианопропильные группы (сорбент CN);

– аминопропильные группы (сорбент NH 2);

– диольные группы (сорбент диол).

Наиболее часто анализ выполняют на неполярных привитых фазах в обращенно-фазовом режиме с применением сорбента С 18 .

Сорбенты с привитыми фазами, полученные на основе силикагеля, химически устойчивы при значениях pH от 2,0 до 7,0, если другое специально не оговаривается производителем. Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость. Размер частиц сорбента в аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии обычно составляет 3–10 мкм, в препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии – 50 мкм и более. Существуют также монолитные колонки, в которых сорбент представляет собой монолит со сквозными порами, заполняющий весь объем колонки.

Высокая эффективность разделения обеспечивается высокой площадью поверхности частиц сорбента (которая является следствием их микроскопических размеров и наличия пор), а также равномерностью состава сорбента и плотной и равномерной его упаковкой.

Детекторы

В высокоэффективной жидкостной хроматографии используются различные способы детектирования. В общем случае подвижная фаза с растворенными в ней компонентами после хроматографической колонки попадает в ячейку детектора, где непрерывно измеряется то или иное ее свойство (поглощение в ультрафиолетовой или видимой области спектра, флуоресценция, показатель преломления, электропроводность и др.). Полученная при этом хроматограмма представляет собой график зависимости некоторого физического или физико-химического параметра подвижной фазы от времени.

Наиболее распространенными детекторами в высокоэффективной жидкостной хроматографии являются спектрофотометрические. В процессе элюирования веществ в специально сконструированной микрокювете измеряется оптическая плотность элюата при заранее выбранной длине волны. Широкая область линейности детектора позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты смеси на одной хроматограмме. Спектрофотометрический детектор позволяет проводить детектирование при любой длине волны в его рабочем диапазоне (как правило, 190-600 нм). Применяются также мультиволновые детекторы, позволяющие проводить детектирование при нескольких длинах волн одновременно и детекторы на диодной матрице, позволяющие регистрировать оптическую плотность одновременно во всем рабочем диапазоне длин волн (как правило, 190-950 нм). Это позволяет регистрировать спектры поглощения проходящих через ячейку детектора компонентов.

Флуориметрический детектор применяется для определения флуоресцирующих соединений или не флуоресцирующих соединений в виде их флуоресцирующих производных. Принцип действия флуориметрического детектора основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Поглощение обычно проводят в ультрафиолетовой области спектра, длины волн флуоресцентного излучения превышают длины волн поглощенного света. Флуориметрические детекторы обладают очень высокой чувствительностью и селективностью. Чувствительность флуоресцентных детекторов примерно в 1000 раз выше чувствительности спектрофотометрических. Современные флуоресцентные детекторы позволяют не только получать хроматограммы, но и регистрировать спектры возбуждения и флуоресценции анализируемых соединений.

Для определения соединений, слабо поглощающих в ультрафиолетовой и видимой областях спектра (например углеводов), используют рефрактометрические детекторы (рефрактометры). Недостатки этих детекторов – их низкая (по сравнению со спектрофотометрическими детекторами) чувствительность и значительная температурная зависимость интенсивности сигнала (детектор необходимо термостатировать), а также невозможность их использование в режиме градиентного элюирования.

Принцип работы испарительных детекторов лазерного светового рассеяния основан на различии давлений паров хроматографических растворителей, входящих в состав подвижной фазы, и анализируемых веществ. Подвижная фаза на выходе из колонки вводится в распылитель, смешивается с азотом или СО 2 и в виде мелкодисперсного аэрозоля попадает в обогреваемую испарительную трубку с температурой 30 – 160 °С, в которой подвижная фаза испаряется. Аэрозоль из нелетучих частиц анализируемых веществ рассеивает световой поток в камере рассеивания. По степени рассеивания светового потока можно судить о количестве определяемого соединения. Детектор более чувствителен, чем рефрактометрический, его сигнал не зависит от оптических свойств пробы, от типа функциональных групп в определяемых веществах, от состава подвижной фазы и может быть использован в режиме градиентного элюирования.

Электрохимические детекторы (кондуктометрические, амперометрические, кулонометрические и др.). Амперометрический детектор применяют для определения электроактивных соединений, которые могут быть окислены или восстановлены на поверхности твердого электрода. Аналитическим сигналом является величина тока окисления или восстановления. В ячейке детектора имеется по крайне мере два электрода – рабочий и электрод сравнения (хлоридсеребрянный или стальной). К электродам прикладывается рабочий потенциал, величина которого зависит от природы определяемых соединений. Измерения могут проводиться как при постоянном потенциале, так и в импульсном режиме, когда задается профиль изменения потенциала рабочего электрода в течении одного цикла регистрации сигнала. В амперометрическом детекторе используют рабочие электроды из углеродных материалов (наиболее часто стеклоуглеродный или графитовый), и металлические: платиновый, золотой, медный, никелевый.

Кондуктометрический детектор используют для детектирования анионов и катионов в ионной хроматографии. Принцип его работы основан на измерении электропроводности подвижной фазы в процессе элюирования вещества.

Исключительно информативным является масс-спектрометрический детектор, который обладает высокой чувствительностью и селективностью. Последние модели масс-спектрометров для жидкостной хроматографии работают в диапазоне масс m/z от 20 до 4000 а.е.м.

В высокоэффективной жидкостной хроматографии используются также, Фурье-ИК-детекторы, радиоактивности и некоторые другие.

Система сбора и обработки данных

Современная система обработки данных представляет собой сопряженный с хроматографом персональный компьютер с установленным программным обеспечением, позволяющим регистрировать и обрабатывать хроматограмму, а также управлять работой хроматографа и следить за основными параметрами хроматографической системы.

Подвижная фаза

Подвижная фаза в высокоэффективной жидкостной хроматографии выполняет двоякую функцию: обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке и регулирует константы равновесия, а, следовательно, и удерживание в результате взаимодействия с неподвижной фазой (сорбируясь на поверхности) и с молекулами разделяемых веществ. Таким образом, изменяя состав подвижной фазы в высокоэффективной жидкостной хроматографии можно влиять на времена удерживания соединений, селективность и эффективность их разделения.

Подвижная фаза может состоять из одного растворителя, часто из двух, при необходимости – из трех и более. Состав подвижной фазы указывают как объемное соотношение входящих в нее растворителей. В отдельных случаях может указываться массовое соотношение, что должно быть специально оговорено. В качестве компонентов подвижной фазы могут быть использованы буферные растворы с определенным значением рН, различные соли, кислоты и основания и другие модификаторы.

В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие углеводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные растворители с небольшими добавками полярных органических соединений, которые регулируют элюирующую силу подвижной фазы.

В обращено-фазовой хроматографии в качестве подвижной фазы используется вода или водно-органические смеси. Органическими добавками обычно служат полярные органические растворители (ацетонитрил и метанол). Для оптимизации разделения могут использоваться водные растворы с определенным значением рН, в частности буферные раствор, а также различные добавки в подвижную фазу: фосфорная и уксусная кислоты при разделении соединений кислотного характера; аммиак и алифатические амины при разделении соединений основного характера, и другие модификаторы.

На хроматографический анализ большое влияние оказывает степень чистоты подвижной фазы, поэтому предпочтительно применять растворители, выпущенные специально для жидкостной хроматографии (включая воду).

При использовании УФ-спектрофотометрического детектора подвижная фаза не должна иметь выраженного поглощения при выбранной для детектирования длине волны. Предел прозрачности или оптическая плотность при определенной длине волны растворителя конкретного изготовителя часто указывается на упаковке.

Подвижная фаза и анализируемые растворы не должны содержать нерастворившиеся частиц и пузырьки газа. Воду, полученную в лабораторных условиях, водные растворы, предварительно смешанные с водой органические растворители, а также анализируемые растворы необходимо подвергать тонкой фильтрации и дегазации. Для этих целей обычно применяют фильтрование под вакуумом через инертный по отношению к данному растворителю или раствору мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм

Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию

В фармакопейной статье должны быть приведены: полное коммерческое наименование колонки с указанием производителя и каталожного номера, размеры колонки (длина и внутренний диаметр), типа сорбента с указанием размера частиц, размера пор, температура колонки (если необходимо термостатирование), объем вводимой пробы (объем петли), состав подвижной фазы и способ ее приготовления, скорость подачи подвижной фазы, тип детектора и условия детектирования (при необходимости параметры используемой ячейки детектора), описание градиентного режима (если используется), включающее в себя стадию переуравновешивания к исходным условиям, время хроматографирования, подробное описание методики и формулы расчета, описания приготовления стандартных и испытуемых растворов.

В случае использования предколоночной дериватизации в автосамплере приводится информацию о программе работы автосамплера. В случае использования постколоночной дериватизации указывается скорость подачи дериватизирующего реагента, объем петли смешения и ее температура.

Модифицированные виды высокоэффективной жидкостной хроматографии

Ион-парная хроматография

Одной из разновидностей обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии является ион парная хроматография – позволяющая определять ионизированные соединения. Для этого в состав традиционной обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии подвижной фазы добавляют гидрофобные органические соединения с ионогенными группами (ион парные реагенты). Для разделения оснований обычно используют алкилсульфаты натрия, для разделения кислот применяют соли тетраалкиламмония (тетрабутиламмония фосфат, цетилтриметиламмония бромид и др.). В ион-парном режиме селективность разделения неионогенных компонентов будет лимитироваться обращено-фазовым механизмом удерживания, а удерживание оснований и кислот заметно возрастает, при этом улучшается форма хроматографических пиков.

Удерживание в ион-парном режиме обусловлено достаточно сложными равновесными процессами, конкурирующими между собой. С одной стороны, за счет гидрофобных взаимодействий и эффекта вытеснения полярной среды подвижной фазы возможна сорбция гидрофобный ионов на поверхности алкилсиликагеля таким образом, что заряженные группы обращены к подвижной фазе. В этом случае поверхность приобретает ионообменные свойства, и удерживание подчиняется закономерностям ионообменной хроматографии. С другой стороны, возможно образование ионной пары непосредственно в объеме элюента, с последующей ее сорбцией на сорбенте по обращено-фазовому механизму.

Хроматография гидрофильного взаимодействия ( HILIC хроматография)

Хроматография гидрофильного взаимодействия используется для разделения полярных соединений, слабо удерживаемых в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. В качестве подвижной фазы в этом варианте хроматографии используются водно-ацетонитрильные смеси с добавлением солей, кислот или оснований. Неподвижными фазами, как правило, являются силикагели, модифицированные полярными группами (амино-, диольные, цианопропильные группы и т.д.). Более полярные соединения удерживаются сильнее. Элюирующая способность подвижной фазы возрастает с увеличением полярности.

Ионообменная и ионная высокоэффективная жидкостная хроматография

Ионообменная хроматография используется для анализа как органических (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неорганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компонентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионообменными группами сорбента. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионообменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с привитыми ионообменными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами: -NH 3 + , -R 3 N + , -R 2 HN + , -RH 2 N + и др. используются для разделения анионов (аниониты), а сорбенты с группами: -SО 3 – , -RSО 3 – , –СООН, -PО 3 – и др. для разделения катионов (катиониты).

В качестве подвижной фазы в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используют буферные растворы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органических растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.

Ионная хроматография – вариант ионообменной хроматографии, в котором для детектирования определяемых соединений (ионов) используется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного определения изменений электропроводности проходящей через детектор подвижной фазы фоновая электропроводность подвижной фазы должна быть низкой.

Существуют два основных варианта ионной хроматографии.

Первый из них — двухколоночная ионная хроматография, основан на подавлении электропроводности электролита подвижной фазы с помощью второй ионообменной колонки или специальной мембранной системы подавления, находящейся между аналитической колонкой и детектором. При прохождении через систему электропроводность подвижной фазы снижается.

Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хроматография. В этом варианте используется подвижная фаза с очень низкой электропроводностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органические кислоты: бензойную, салициловую или изофталевую.

Эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография

Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) – особый вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах молекул и частично на их форме и полярности.

Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы с размерами, превышающими максимальный диаметр пор, вообще не удерживаются и элюируются первыми, перемещаясь одновременно с подвижной фазой. Молекулы с размерами, меньшими чем минимальный диаметр пор сорбента, свободно проникают в поры и элюируются из колонки последними. Остальные молекулы, имеющие промежуточные размеры, удерживаются в порах частично и в ходе элюирования разделяются на фракции в соответствии со своими размерами и, частично, формой проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. В результате вещества элюируются с различными временами удерживания.

Ионоэксклюзионная хроматография

В основе механима ионоэксклюзионной хроматографии лежит эффект, в результате которого соединения в ионизированной форме не удерживаются на сорбенте-ионообменнике, тогда как соединения в молекулярной форме распределяются между неподвижной и водной фазами внутри пор ионообменного сорбента и подвижной фазой мигрирующее в пространстве между частицами сорбента. Разделение основано на электростатическом отталкивании, полярных и гидрофобных взаимодействиях между растворенными соединениями и сорбентом.

Анионогенные группы на поверхности сорбента действуют как полупроницаемая «мембрана» между стационарной и подвижной фазами. Отрицательно заряженные компоненты не достигают стационарной подвижной фазы, так как отталкиваются одноименно заряженными функциональными группами и элюируются в «мертвом» (свободном) объеме колонки. Компоненты в молекулярном виде не «отторгаются» катионообменным сорбентом и распределяются между стационарной и подвижной фазами. Различие в степени удерживания неионных компонентов смеси продиктовано совокупностью полярных взаимодействий неионных компонентов с функциональными группами катионообменного сорбента и гидрофобных взаимодействий неионных компонентов с неполярной матрицей сорбента.

Хиральная хроматография

Целью хиральной хроматографии является разделение оптических изомеров. Разделение осуществляется на хиральных неподвижных фазах или на обычных ахиральных неподвижных фазах с использованием хиральных подвижных фаз. В качестве хиральных неподвижных фаз используются сорбенты с поверхностью модифицированной, группами или веществами, имеющими хиральные центры (хитозаны, циклодекстрины, полисахариды, белки и др. (хиральные селекторы). В качестве подвижных фаз в этом случае могут использоваться те же фазы, что и в нормально-фазовой или обращенно-фазовой хроматографии. При использовании ахиральных неподвижных фаз для обеспечения разделения энантиомеров в подвижные фазы добавлятся хиральные модификаторы: хиральные комплексы металлов, нейтральные хиральные лиганды, хиральные ион-парные реагенты и др.

Ультраэффективная жидкостная хроматография

Ультраэффективная жидкостная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, отличающийся большей эффективностью по сравнению с классической высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Особенностью ультраэффективной жидкостной хроматографии является использование сорбентов с размером частиц от 1,5 до 2 мкм. Размеры хроматографических колонок обычно составляют от 50 до 150 мм в длину и от 1 до 4 мм в диаметре. Объем вводимой пробы может составлять от 1 до 50 мкл. Использование таких хроматографических колонок позволяет значительно уменьшить время анализа и повысить эффективность хроматографического разделения. Однако, при этом давление на колонке может достигать 80 – 120 МПа, требуемая частота сбора данных детектора может возрастать до 40-100 герц, внеколоночный объем хроматографической системы должен быть минимизирован. Хроматографическое оборудование и колонки, используемые в ультраэффективной жидкостной хроматографии специально адаптированы для выполнения требований этого вида хроматографии.

Оборудование, предназначенное для ультраэффективной жидкостной хроматографии, может использоваться и в классическом варианте высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Содержащий смесь образца через колонку, заполненную твердым адсорбирующим материалом . Каждый компонент в образце взаимодействует несколько иначе, с адсорбирующим материалом, в результате чего различные скорости потока для различных компонентов и приводит к разделению компонентов, поскольку они вытекают из колонны.

ВЭЖЙ были использовано для изготовления (например , в процессе производства фармацевтических и биологических продукты), правовой (например , обнаружение наркотиков повышения производительности в моче), исследование (например , разделение компонентов комплексного биологического образца, или аналогичных синтетических химических веществ друг от друга), и медицинской (например , обнаруживать уровни витамина D в сыворотке крови) цели.

Использование более полярных растворителей, в подвижной фазе, будет уменьшать время удерживания аналитов, в то время как более гидрофобные растворители, как правило, вызывают более медленные элюирования (увеличение времени удерживания). Очень полярные растворители, такие как следы воды в подвижной фазе, как правило, адсорбируются на твердую поверхность неподвижной фазы, образующей неподвижный слой связанного (воду) , который считается играть активную роль в сохранении. Такое поведение является несколько свойственный нормальной фазовой хроматографии, поскольку она регулируется почти исключительно с помощью механизма адсорбционного (т.е. , аналитов взаимодействуют с твердой поверхностью, а не с сольватированного слоем лиганда, прикрепленной к поверхности сорбента; смотри также обращенно-фазовой ВЭЖХ ниже). Адсорбционная хроматография до сих пор широко используются для структурных изомеров разделений в обеих столбцах и тонкослойных форматах хроматография на активированном (высушенный) кремнезем или глинозем опоре.

Partition- и НП-ВЭЖХ выпал из пользу в 1970 - х с развитием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии из - за плохой воспроизводимости времени удерживания в связи с наличием воды или протонном слоя органического растворителя на поверхности диоксида кремния или оксида алюминия хроматографических сред, Этот слой изменяет с любыми изменениями в составе подвижной фазы (например , уровень влажности) , что вызывает дрейфующих времена удерживания.

В последнее время, распределительная хроматография стала популярной снова с развитием Hilic скрепленных фаз, которые демонстрируют улучшенные воспроизводимости, и из - за лучшее понимание диапазона полезности техники.

Объем хроматографии

Вытеснительной хроматографии

Размер-эксклюзионной хроматографии (SEC), также известный как гель - проникающей хроматографии или гель - фильтрационной хроматографии , отделяет частицы на основе молекулярного размера (на самом деле с помощью частицы радиуса Стокса). Это, как правило, разрешение хроматография низкая и, таким образом, он часто зарезервирован для окончательной полировки, «» стадии очистки. Это также полезно для определения третичной структуры и четвертичной структуры очищенных белков. SEC используется в основном для анализа больших молекул, таких как белки или полимеры. SEC работает за счет захвата этих меньших молекул в порах частицы. Более крупные молекулы просто проходят мимо пор, как они слишком велики, чтобы войти в поры. Поэтому крупные молекулы, протекать через колонку быстрее, чем более мелкие молекулы, то есть, чем меньше молекула, тем дольше время удерживания.

Этот метод широко используется для определения молекулярной массы полисахаридов. SEC является официальным метод (предложенный Европейской фармакопее) для молекулярного веса по сравнению различных коммерчески доступных низкомолекулярных гепаринов .

Ионообменная хроматография

В ионообменной хроматографии (IC), удержание на основе притяжения между ионами растворенным веществом и заряженными объектами, связанными с неподвижной фазой. Ионы растворенных веществ одного и того же заряда как заряженные участки на колонке исключается из связывания, в то время как растворенные ионы противоположного заряда заряженных участков колонны удерживаются на колонке. Ионы растворенных веществ, которые сохраняются на колонке, можно элюировать с колонки путем изменения условий растворителя (например , увеличение ионной эффект системы растворителей путем увеличения концентрации соли в растворе, повышение температуры колонки, изменения рН растворителя, так далее.).

Типы ионообменников включают в себя полистирольные смолы, целлюлозы и декстрана ионообменников (гели), а также с контролируемым пористое стекло или пористый диоксид кремни. Полистирольные смолы позволяют кросс связь, которая увеличивает стабильность цепи. Выше поперечное сцепление уменьшает сворачивание, что увеличивает время установления равновесия и в конечном счете повышает селективность. Целлюлоза и декстраны иониты обладают большим размером пор и плотности низкого заряда делают их пригодными для разделения белков.

В общем, ионообменники пользу связывания ионов большего заряда и меньшего радиуса.

Узкий расточки колонны (1-2 мм) используются для применений, когда больше чувствительности желательно либо с помощью специальных UV-VIS детекторы, флуоресценции обнаружения или с помощью других методов обнаружения, как для жидкостной хроматографии-масс - спектрометрии

Капиллярных колонок (до 0,3 мм) используются почти исключительно с альтернативным средства обнаружения, таких как масс - спектрометрии . Они, как правило, изготовлены из плавленого кварца капилляров, а не трубки из нержавеющей стали, что большие колонны нанимать.

Размер частицы

Большинство традиционных ВЭЖХ проводят с неподвижной фазой, прикрепленной к внешней стороне небольших сферических кварцевых частиц (очень маленьких шариков). Эти частицы бывают различных размеров с 5 мкм бусин являются наиболее распространенными. Более мелкие частицы обычно обеспечивают большую площадь поверхности и более разделения, но давление, необходимое для достижения оптимального линейного увеличения скорости по обратной величине диаметра частиц в квадрате.

Это означает, что изменение к частицам, которые в два раза большим, сохраняя размер столбца то же самое, удвоит производительность, но увеличивают требуемое давление, в четыре раза. Более крупные частицы используют в препаративной ВЭЖХ (колонка диаметром 5 см до> 30 см) , и для не-ВЭЖХ приложений, таких как твердофазной экстракции .

размер пор

Многие стационарные фазы являются пористыми, чтобы обеспечить большую площадь поверхности. Малые поры обеспечивают большую площадь поверхности, в то время как больший размер пор имеет лучшую кинетику, особенно для больших аналитов. Например, белок, который лишь немного меньше, чем поры может ввести поры, но не легко оставить один раз внутри.